Биологическая активность почвы и методы ее определения

Измерение интенсивности  дыхания почвы камерным статистическим методом. Данный метод относится  к полевым методам определения  газообмена CO₂ в системе «почва-растение-атмосфера» и предусматривает измерение скорости накопления СО₂ внутри изолятора, врезаемого в почву на глубину 5-10 см. Изолятор выдерживают в почве 15-30 мин, отбирая в динамике пробы воздуха из изолируемого объема надпочвенной атмосферы. Для отбора проб в стальных изоляторах имеются отверстия, закрытые резиновыми пробками. Отбор производят шприцами типа «Рекорд» объемом 10-20 мл. Пробы для анализа хранят в пенициллиновых или инсулиновых флакончиках с водно-солевыми растворами. После транспортировки в лабораторию производят определения концентрации углекислого газа в пробах методом газовой хроматографии.

 

 

2.3. Метод инициированного микробного сообщества.

 

С помощью сканирующего электронного микроскопа в сочетании  с классическими методами микробиологии изучается структура и особенности инициированного субстратом сообщества почвенных микроскопических обитателей. Отмечают доминирование и соотношение отдельных групп бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей, простейших и микроскопических беспозвоночных животных.

Метод заключается  в следующем. Нестерильную почву  в воздушно-сухом состоянии растирают  в ступке, предварительно удалив крупные  корешки, просеивают через сито 1 мм, увлажняют дистиллированной водой  до 60% полевой влагоемкости и тщательно перемешивают. Пастообразную массу почвы вносят в маленькие чашки Петри диаметром 4 см до краев и слегка уплотняют шпателем так, чтобы образовалась ровная поверхность. На поверхность почвенной пластинки в чашке Петри наносят тонкий слой крахмала полоской в 1 см по диаметру чашки. Для этого на тонкий слой крахмала осторожно накладывают два чистых листа бумаги так, чтобы расстояние между ними было 1 см, чашку с почвой переворачивают и по диаметру чашки прикладывают на 1 см к образовавшейся полоске. Лишнее количество крахмала сдувают сжатым воздухом так, чтобы на почве осталась тонкая полоска не более двух-трех слоев крахмальных зерен. Чашки с почвой помещают в  другие чашки большего размера, на дно которых налита дистиллированная вода для поддержания постоянной влажности. В таком состоянии чашки инкубируют при 25^оС в термостате в течение 2-3 недель. За развитие микроорганизмов на полоске крахмала наблюдают визуально с помощью лупы, светочувствительного и сканирующего электронного микроскопов. В сканирующем микроскопе наблюдается развитие бактенрий, актиномицетов, грибов и беспозвоночных животных. При использовании описанного подхода в макромасштабах воспроизводится аэробная микрозона, обогащенная органическим веществом (крахмалом). С помощью этого метода удалось установить, что обычно в заданных узких условиях процесс ведут несколько доминирующих видов. Антропогенные воздействия (удобрения, пестициды, загрязнения в виде тяжелых металлов) независимо от природы действующего фактора, изменяют микрофлору, активно ведущую процесс в соответствии с общими законами. Подход дает возможность определять ряд микробиологических характеристик почв, в том числе и допустимые нагрузки того или иного фактора на почву. При увеличивающихся нагрузках каждый фактор вызывает в микробном сообществе изменения, соответствующие следующим состояниям системы: состоянию гомеостаза, стресса, развития резистентных форм, репрессии[6].

 

 

2.4. Ацетиленовый метод определения потенциальной активности азотфиксации.

 

Нитрогеназа азотфиксирующих микроорганизмов способна восстанавливать ацетилен до этилена. Оба непредельных углеводорода легко идентифицируются при помощи газового хроматографа. Ацетиленовый метод определения азотфиксирующей активности бактерий разработан Харви с соавт. Чувствительность метода позволяет обнаружить до 10^-12 М этилена и превосходит чувствительность масс-спектрометрического определения азота и определения азота по Кьельдалю. Поскольку азотфиксацию осуществляют аэробные и анаэробные свободноживущие и симбиотические бактерии, схема экспериментов должна быть различной.

Используют  несколько вариантов этого метода[1]:

1. Отбор проб почв с последующей инкубацией в атмосфере ацетилена.
2. Способ почвенных монолитов, при котором часть почвы инкубируют с ацетиленом в газонепроницаемом контейнере.
3. Полевой диффузионный метод «колпаков», заключающийся в том, что поверхность почвы накрывают газонепроницаемым колпаком, под который вводят ацетилен.

4. Выдерживание монолита почвы с растением в продуваемой через почву ацетилен-воздушной смеси.

Во всех случаях  ацетилен вводят в воздушное пространство в количестве 10% от объема сосуда или  «колпака» или с заведомым  избытком.

Применение  ацетиленового метода в полевых  условиях сопряжено с несколькими  сложностями: введение в почву ацетилена может сопровождаться его адсорбцией или, напротив, затрудненной диффузией. Образующийся этилен также способен адсорбироваться почвой, а при отсутствии ацетилена, напротив, выделяться ею. В герметичной камере, особенно при длительной экспозиции, возникает парниковый эффект – увеличение концентрации СО₂ в составе газовой смеси. Следствием его является явление фотосинтеза, в результате чего усиливается отток корневых выделений, способствующий повышению активности микроорганизмов.

В соответствии с методом Харди с соавт, питательную среду помещают в шприцы на 10 мл, атмосферный воздух удаляют вакуумным насосом, соединенным со шприцем и манометром, а содержимое шприца (инокулят) трижды промывают аргоном. Затем шприцы заполняют газовой смесью аргон + 2% ацетилен (для анаэробов). Для аэробных микроорганизмов вводят 2-10% кислорода. После заполнения шприца газовой смесью иглу снимают, отверстие закрывают силиконовой пробкой, через которую впоследствии берут газовые пробы инсулиновым шприцем для анализа на газовом хроматографе. Продолжительность опыта определяется его целями и активностью культуры: острый опыт идет до 3 суток.

В конце опыта  реакцию восстановления ацетилена  прекращают, добавляя к культурной среде 0,2 мл 40%-ного NaOH. Газовую смесь готовят в газометрах заранее (за 24 ч до опыта), чтобы обеспечить наиболее полную диффузию газовых составляющих.

Ацетилен и  этилен определяют на газовом хроматографе с пламенным ионизационным детектором по времени выхода каждого газа, сравнивая его со временем выхода известного стандартного газа. Колонку (1,5 м длиной и 4 мм диаметром) заполняют сорбентом (селикагелем АСК). В качестве газоносителя используют водород, устанавливая его расход равным 36 мл/мин. Температура колонки 50^оС, объем вводимой газовой пробы 0,5 мл. Количество газов рассчитывают по калибровочной кривой. В длительных экспериментах для определения азотфиксирующей активности почвы пользуются флаконами из-под пенициллина или стеклянными сосудами на 16 мл с силиконовой пробкой и боковым отростком, перекрывающимся притертым стеклянным затвором. В последнем случае через боковой отросток легко удалять необходимый инертный газ и наполнять им сосуд.

 

2.5. Определение потенциальной активности денитрификации в почве.

 

Денитрификация  – микробиологический процесс, играющий важную роль в азотном балансе почв. Существуют различные приемы оценки денитрифицирующей активности почвы. В практике микробиологических исследований широкое применение получили газохроматографические методы определения активности денитрификации по скорости эмиссии газообразных продуктов денитрификации из почвы. Самым распространенным приемом для оценки денитрифицирующей активности почвенных микроорганизмов является метод, основанный на использовании ацетилена в качестве ингибитора редуктазы закиси азота, что позволяет судить об активности процесса по накоплению закиси азота в газовой фазе.

Определение проводят в стеклянных сосудах, имеющих боковой  отросток, перекрывающийся притертым  стеклянным затвором и отверстием сверху, которое после внесения в сосуд почвы, глюкозы (13,3 мг на 1 г почвы) и нитрата калия (0,5 мг на 1 г почвы) в виде растворов закрывается пробкой из силиконовой резины. Такая пробка позволяет производить многократный отбор проб газа без потери герметичности. При открытом затворе через боковой отросток с помощью вакуумного насоса, соединенного с манометром, эвакуируют атмосферный воздух и проводят 2-3 кратную промывку содержимого сосуда инертным газом, который вводят с помощью шприца, а затем откачивают через боковой отросток. Для этой цели применяют аргон или гелий.

Затем половину сосудов заполняют газовой смесью с 1,5% ацетилена, а другую – с 10% ацетилена. Большая концентрация ацетилена  тормозит утилизацию N₂O бактериями, что дает возможность надежно фиксировать максимум образовавшегося в процессе денитрификации N₂O и позволяет подстраховать исследователя в том случае, если в вариантах с меньшим содержанием ацетилена его уловить не удалось.

Газовые смеси  готовят в газометрах за 24 ч до опыта. Количество образовавшегося N₂O рассчитывают по калибровочным кривым. Определение всех газовых компонентов смеси расширяет возможности метода, позволяет наблюдать смену процессов, обусловленную активностью отдельных физиологических групп микроорганизмов и изучать воздействие на них отдельных факторов.

 

2.6. Методы определения активности ферментов в почве.

 

Ферменты –  биологические катализаторы белковой природы, которые играют важнейшую  роль в обмене веществ, регулируя  биохимические процессы. Они синтезируются  микрофлорой, высшими растениями и поступают в почву с их прижизненными выделениями, после отмирания. Ферменты, выделяемые в почву, значительное время сохраняют активность благодаря фиксации илистой и пылеватой фракциям почв, ее органическим веществом. Ферментативная активность почв определяет интенсивность и направленность биохимических процессов, от которых зависит плодородие почвы и является одним из важных показателей ее биологической активности. На активность ферментов в почве влияют различные факторы, ингибирующие или активизирующие их действие. Активность ферментов в почве зависит от ее физико-химических показателей, засоленности, карбонатности, окультуренности, внесения удобрения. Определение активности ферментов важно для оценки влияния агрохимических средств на биологическую активность почвы без привлечения специальных микробиологических методов, чтобы судить о мобилизации органических соединений азота, фосфора, серы и др. для питания растений. Ферментативную активность почвы определяют с помощью традиционных химических методов. Наиболее простыми из них по выполнению являются методы определения дегидрогеназ и инвертазы.

Для определения  активности дегидрогеназ в почве  в качестве акцептора водорода применяют  бесцветные соли тетразолия, которые  восстанавливаются в красные  соединения формазанов. Навеску 1 г почвы помещают в 50 мл вакуумную колбу с притертыми стеклянными пробками, добавляют 10 мг углекислого кальция и тщательно смешивают. Для определения дегидрогеназ лучше использовать свежие образцы почвы, т.к. при высушивании образцов почвы их активность падает до 50-80%. Затем добавляют 1 мл 1%-ного солей тетразолия. Определение проводят в анаэробных условиях, для этого воздух из колбы эвакуируют при разрежении 10-12 мм рт.ст в течение 2-3 мин. Колбы осторожно встряхивают и ставят в термостат при 38^оС на 24 ч. Контролем служит стерилизованная почва и субстраты без почвы. После окончания инкубации в колбы добавляют по 25 мл этилового спирта и встряхивают в течение 5 мин. Содержимое колбы фильтруют, и полученный раствор формазанов анализируют на фотоэлектроколоримтре, используя кюветы шириной 5 мм и синий светофильтр с длиной волны 500-600 нм. Количество формазана в мг рассчитывают по стандартной кривой. Для составления калибровочной кривой готовят стандартный раствор формазана в этиловом спирте (0,1 г в 1 мл), затем в мерные колбы на 25 мл берут соответствующее количество стандартного раствора, содержащего от 0,1 до 1 мг формазана, этанолом доводят до метки и фотоколориметрируют согласно вышеописанному способу. Ошибка определения – до 8%[3].

Фотоколориметрический метод определения активности инвертазы  заключается в следующем. В колбу  емкостью 50 мл помещают 5 г почвы, добавляют 10 мл 5%-ного раствора сахарозы, 10 мл ацетатного буфера (pH 4,7) и 5-6 капель толуола. Колбы закрывают пробками, встряхивают и помещают в термостат при температуре 30^оС на 24 часа, периодически встряхивая их. Контроль – стерилизованная почва (3 ч при 180^оС) и чистый субстрат. После инкубации содержимое колб фильтруют в 100-мл мерные колбы. Из фильтра берут 6 мл в большие пробирки, добавляют 3 мг сегнетовой соли и 3 мл раствора сернокислой меди, хорошо перемешивают и кипятят на водяной бане в течение 10 мин. Затем пробирки с раствором охлаждают в холодной воде, содержимое переносят в пробирки и центрифугируют в течение 5-7 мин при 3000 об/мин. Прозрачный центрифугат колориметрируют на фотоэлектроколориметре (светофильтр 630 нм), кюветы шириной 1 см. Количество глюкозы рассчитывают по предварительно составленным калибровочным кривым. Исходный стандартный раствор – 6 мг глюкозы в 1 мл. Активность инвертазы выражают в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за сутки. Ошибка определения – до 5%[3].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

 

Биологическую активность почв следует рассматривать  комплексно, т.к. в настоящее время  нет какого-то единого универсального метода определения биологической  активности почвы.

Биологическую активность почв определяют, пользуясь  самыми различными микробиологическими (прямой подсчет микроорганизмов разных групп), биохимическими (определение ферментативной активности почв), физиологическими (физиологический метод определения биомассы организмов, определения дыхания почв) и химическими (определение нитратов, нитритов, аммония) методами.

Все эти методы можно разделить на две группы:

1. Методы определения актуальной (полевой) биологической активности в почвах (полевые методы определения дыхания, азотфиксации, денитрификации, некоторые изотопные методы).
2. Методы определения потенциальной биологической активности почв, т.е. той активности, которая обнаруживается в лаборатории при оптимальных условиях для прорастания данного процесса (определение ферментативной активности почв, лабораторные методы определения нитрификации, азотфиксации, денитрификации, интенсивности дыхания).

На мой взгляд наиболее прогрессивным методом  будет являться биохимический метод  –определение ферментативной активности почв, т.к. ферменты это те вещества, которые синтезируются живыми организмами и поступают в почву с их прижизненными выделениями и после отмирания.  Таким образом, взаимосвязь микроорганизмов и биологической активности почв очевидна и от этого взаимодействия будет зависть  плодородие.