Биохимия и физиология бактерий

Классификация бактериальных  ферментов:

• По механизму действия:
• оксидоредуктазы катализируют окислительно-восстановительные реакции (перенос электронов);
• трансферазы катализируют реакции, идущие с переносом молекул или атомных группировок от одних соединений к другим;
• лиазы катализируют реакции негидролитического расщепления органических веществ, сопровождаемые отщеплением от них H₂O, CO₂ и NH₃;
• гидролазы катализируют реакции гидролитического расщепления и синтеза органических веществ, идущие с участием H₂O;
• изомеразы осуществляют внутримолекулярные перемещения радикалов и атомов, превращая органические соединения в их изомеры;
• лигазы (синтетазы) катализируют реакции синтеза сложных органических соединений из простых.
• По локализации:
• экзоферменты – ферменты, выделяемые наружу, в окружающую среду; расщепляют сложные органические вещества до более простых молекул, которые способны проходить через ЦПМ;
• эндоферменты функционируют внутри клетки, осуществляя дальнейшее расщепление питательных веществ, а также участвуют в синтезе структур бактериальной клетки.
• По субстрату воздействия:
• сахаролитические;
• протеолитические;
• липолитические.
• По концентрации в окружающей среде:
• конститутивные – это ферменты микроорганизов, всегда синтезирующиеся с постоянной скоростью и присутствующие в клетке в постоянных концентрациях (синтез их запрограммирован), например, ферменты гликолитического пути;
• индуцибельные (адаптивные) – это ферменты, концентрация которых резко изменяется в зависимости от наличия или отсутствия в среде субстрата;
• репрессибельные – это ферменты, синтез которых подавляется в результате избыточного накопления продукта реакции, катализируемой данным ферментом.

Ферменты патогенности – это ферменты, субстратами для которых являются вещества, входящие в состав клеток и тканей макроорганизма, способствующие проникновению, распространению и размножению микроорганизмов, т.е. проявлению патогенных свойств (нейраминидаза, гиалуронидаза, коагулаза).

Методы изучения ферментативной активности.

В бактериологической практике для  идентификации бактерий определяют сахаролитическую и протеолитическую активность ферментов.

Для определения сахаролитических ферментов используют среды с сахарами:

• среды Гисса (пестрый ряд):
• жидкие – пептонная вода, индикатор Андреде (кислый фуксин), углеводы, спирты;
• полужидкие – пептонная вода, 0,5% агар-агар, индикатор бромкрезол, углеводы, спирты;
• короткие – содержащие моносахара и дисахара (глюкоза, мальтоза, лактоза, сахароза, маннит);
• длинные – короткий ряд + моносахара (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахариды (инулин, крахмал и др.), спирты (глицерин, дульцит, инозит и др.).
• среда Ресселя – двухсахарный агар (лактоза, глюкоза) и индикатор бромтимоловый синий, Олькеницкого – трехсахарный агар (лактоза, сахароза, глюкоза), индикатор нейтральный красный и соль Мора для выявления H₂S.

Под действием сахаролитических ферментов  бактерий углеводы и многоатомные спирты расщепляются до кислоты/кислоты и газа. Для обнаружения газа в жидкие среды помещают поплавки, которые при образовании газа всплывают, а в полужидких – заметно появление пузырьков. Для обнаружения кислоты добавляют индикатор, который под ее действием изменяет цвет.

• среды Эндо, Левина, Плоскирева – МПА с лактозой и индикаторами – фуксином, метиленовым синим и нейтральным красным соответственно.

У бактерий, ферментирующих лактозу (лактоза+), колонии окрашиваются в цвет индикатора и приобретают металлический блеск, у лактоза– бактерий колонии остаются бесцветными.  

Для определения  протеолитических ферментов используют:

• определение конечных продуктов распада белков (индол, H₂S, аммиак);

Сероводород, индол и аммиак определяют, помещая под пробку пробирки с растущей на МПБ культурой индикаторные бумажки:

• индол (выделяется при разложении триптофана), окрашивает в розовый цвет индикаторную бумажку, пропитанную щавелевой кислотой;
• H₂S (продукт распада серосодержащих аминокислот – цистеина, метионина), реагируя с ацетатом свинца на индикаторной бумажке, превращается в сульфат свинца и окрашивает бумажку в черный цвет;
• о наличии аммиака свидетельствует посинение лакмусовой бумажки.
• способность разжижать желатин (в виде воронки, перевернутой елочки);
• способность свертывать или пептонизировать плазму крови и молоко.

 

Понятие метаболизма  бактерий.

Метаболизм (обмен веществ) – это совокупность всех протекающих в клетке химических превращений, обеспечивающих воспроизводство ее биомассы и жизнеспособность.

Метаболизм складывается из 2-х  взаимосвязанных, но противоположных  процессов: катаболизма и анаболизма.

Катаболизм (энергетический метаболизм / диссимиляция) – это процессы расщепления сложных молекулярных соединений до более простых, идущие с выделением энергии и запасанием ее в молекулах АТФ и других макроэргических соединений.

Анаболизм (конструктивный / пластический метаболизм / ассимиляция / биосинтез) – это реакции, в результате которых синтезируются сложные соединения и структурные компоненты клетки за счет поступающих извне простых веществ, идущие с потреблением энергии, полученной в процессе энергетического метаболизма.

Необходимо отметить, что на определенных этапах анаболизма и катаболизма образуются одинаковые промежуточные продукты (амфиболиты), которые используются в обоих процессах.

Энергетический  метаболизм. Механизм биологического  окисления.

В процессе жизнедеятельности  бактерии постоянно нуждаются в  энергии, она используется для переноса  в клетку питательных веществ, необходимых  для воспроизводства клеточных структур, для синтеза многих соединений, расходуется при движении и размножении  бактерий.

Большинство бактерий получает энергию  путем  биологического окисления.

Биологические окисление – окисление органических или неорганических веществ живыми организмами, происходит путем дегидрирования, т.е. отнятия атомов водорода (электронов) от окисляемого вещества (донора) с последующим переносом на другое вещество (акцептор), которое при этом восстанавливается.

В результате высвобождается энергия, которая накапливается в виде макроэргических соединений: АТФ (аденозинтрифосфат), ГТФ (гуанозинтрифосфат), ЦТФ  (цитидинтрифосфат), ФЕП (фосфоенолпируват), УТФ (уридинтрифосфат), дТТФ (дезокситимидинтрифосфат), ацетилфосфат, креатинфосфат, ацетилкоэнзим А (ацетил-КоА). Среди них наиболее важен АТФ, т.к. это – термодинамически неустойчивая молекула  и последовательно отщепляет фосфат с образованием аденозиндифосфата (АДФ) или аденозинмонофосфата  (АМФ). Это позволяет АТФ выполнять функции переносчика химической энергии, необходимой для обеспечения  энергетических потребностей бактериальных клеток. При образовании фосфатных связей АТФ требуется энергия, но при их разрыве она выделяется  в еще больших количествах.

Схема биологического окисления:

 

Донор  Н⁺   АДФ               АТФ        Акцептор Н⁺

                            электроны            

Образование АТФ происходит в процессе фосфорилирования. Фосфорилирование – это процесс переноса фосфатной группы с образованием макроэргических связей.

Виды  фосфорилирования:

• фотофосфорилирование (фотосинтез);
• субстратное фосфорилирование (брожение);
• окислительное фосфорилирование (дыхание).

Фотосинтез – это процесс преобразования световой энергии в клетках фототрофных бактерий в биохимическую доступную энергию (протонный градиент, который с помощью фермента АТФ-синтетазы консервируется в виде АТФ). У бактерий аналог хлоропластов растительных клеток – хроматофоры, содержащие хлорофилл и каротиноидные пигменты.

Субстратное фосфорилирование (брожение) – это способ получения энергии, при котором происходит сопряженное окисление-востановление субстрата без участия кислорода (в строго анаэробных условиях).

Это наиболее примитивный способ получения энергии, т.к. из субстрата извлекается лишь незначительная часть содержащейся в нем энергии.

Брожение было известно человеку давно, однако биологическая сущность доказана в работах Л. Пастера, который установил, что изменения в органическом субстрате – результат жизнедеятельности микроорганизмов.

 

 

 

Процесс брожения протекает в две фазы:

1. Начальная (окисление) – расщепление углеводов до пировиноградной кислоты (пирувата) тремя путями:
• гликолитический (гликолиз, путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, фруктозо-1,6-дисфосфатный путь) – 2 АТФ и 2 НАДН₂;
• пентозофосфатный (путь Варбурга-Диккенса-Хорекера-Рэкера, фосфоглюконатный путь) – 2 АТФ, 2 НАДФН, пентозофосфат и СО₂;
• 2-кето-3дезокси-6-фосфоглюконатный (путь Энтнера-Дудорова, отличается тем, что глюкоза без фосфорилирования окисляется в глюконовую кислоту, последняя превращается в 2-кето-З-фосфоглюконовую кислоту, которая расщепляется на два C₃-фрагмента: ПВК и глицериновый альдегид) – наблюдается только у бактерий рода Pseudomonas, Alcaligenes, у высших организмов отсутствует – 1 АТФ, 1 НАДФ и 1 НАДН₂;
2. Конечная (восстановление) – происходит присоединение атомов водорода для восстановления пировиноградной кислоты, при этом образуются разные продукты, в зависимости от которых выделяют разные типы брожения.

Схема субстратного фосфорилирования (брожения):

Питательный субстрат                          ПВК      ^{дегидразы}          конечный продукт

            (глюкоза)

Типы брожения:

Тип брожения	Конечный продукт	Микроорганизмы
Молочно-кислое гомоферментативное   гетероферментативное	молочная кислота   молочная кислота + этиловый спирт, СО2, уксусная кислота, ацетоин, диацетил	лактобактерии, стрептококки бифидумбактерии
Спиртовое	этанол	дрожжи
Масляно-кислое	масляная кислота	клостридии
Муравьино-кислое	муравьиная кислота	энтеробактерии
Пропионово-кислое	пропионовая кислота	пропионибактерии
Ацетонобутиловое	бутиловый спирт и ацетон	Clostridium acetobutylicum

 

Процесс субстратного фосфорилирования (брожения) имеет свои достоинства и недостатки.

Достоинства брожения:

• освобождение энергии, необходимой для жизнедеятельности бактерий;
• образование веществ, необходимых для жизнедеятельности человека;

 

 

Недостатки брожения:

• неполное окисление субстрата;
• при расщеплении 1 молекулы глюкозы образуется только 2 молекулы АТФ;
• в качестве донора и акцептора электронов служат только органические вещества;
• происходит в строго анаэробных условиях.

Окислительное фосфорилирование (дыхание) – это процесс образования АТФ при переносе электронов от донора к акцептору через дыхательную цепь.

Схема окислительного фосфорилирования (дыхания):

 

       белки                                    глюкоза                                        жиры

                                                  ^{гликолиз}             

полипептиды                               пируват                               β-окисление

                       ^{дезаминирование}                  

аминокислоты                         ацетил-КоА

 

                                                                                                              

                                                                                    

                                             8H⁺                                

                                                                                               O₂ + 2H⁺ --- H₂O                    

НАД                    2НАДН₂ →    убихинон →  система               ^аэробы

ФАД                    ФАДН₂                             цитохромов        NO₃^- --- NH₃

НАДФ               НАДФН₂                                                          SO₄^2- --- H₂S    

                                                                                                         ^{анаэробы}                                                     

Донором электронов могут служить органические (углеводы, жирные кислоты, аминокислоты) и неорганические вещества: H₂S, Fe³⁺ («сероводородное дыхание», «железное дыхание»). Акцептором электронов – только неорганические вещества, которые восстанавливаются. В зависимости от конечного акцептора электронов различают аэробное и анаэробное дыхание.