Генная инженерия

Один из важных этапов конструирования молекулы ДНК – лигирование (или сшивание) генов с помощью фермента ДНК-лигазы. Сшивание фрагментов ДНК, содержащих нужные гены, осуществляют двумя основными методами: а) по «липким» концам; б) с помощью искусственно достроенных  «липких» концов.

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимнокомплементарным участкам, длиной из 4 – 6 пар нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами в соответствии с рисунком 3.

                   

                                      Рисунок 3

                   Сшивание  по «липким» концам

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают, т.е. синтезируют искусственно ферментативным путем. Для этой цели применяют так называемые линкеры (или «переходники») – короткие участки ДНК, имеющие разные «липкие» концы в соответствии с рисунком 4.

 

              

                                                          Рисунок 4

    Сшивание при отсутствии комплементарных «липких» концов

Линкерные фрагменты не только обеспечивают объединение генов, но и обусловливают их экспрессию, в связи с чем часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например промотор, или участок связывания с рибосомой.

Возможно сшивание фрагментов и по тупым концам, когда концы фрагментов двунитевые в соответствии с рисунком 5.

 

                   

Рисунок 5

                        Сшивание фрагментов по тупым  концам

В этом случае реакция лигирования имеет биохимические особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по «липким» концам.

После того как рекомбинантная ДНК сшита, ее вводят в живые клетки.[1]

3.3 Введение рекомбинантной  ДНК в клетку 

 

К настоящему времени сконструировано множество типов векторов на основе разнообразных плазмид и вирусов.

Плазмиды являются основным материалом векторов. Геном плазмид представляет собой кольцевую ДНК и имеет систему контроля репликации, которая поддерживает их количество в бактериальной клетке на определенном уровне. Многие плазм иды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам.

На первых этапах генной инженерии применяли естественные плазмиды бактерий. Сейчас создают искусственные (рекомбинантные) плазмиды со стандартными свойствами. Они обычно содержат один сайт рестрикции к какой-либо одной рестриктазе, несут два гена устойчивости к разным антибиотикам и имеют ослабленный контроль репликации. Контроль репликации, свойственный природным плазмидам, ограничивает число плазмид в клетке. Обычно бактериальная клетка имеет 20- 30 плазмид, но ослабленный контроль репликации позволяет накапливать в клетке более 1000 плазмид.

Разрыв ДНК плазмиды в сайте рестрикции превращает ее в линейную молекулу. Если той же рестриктазой была разрезана и чужеродная ДНК для выделения нужного гена, то этот ген можно «сшить» с плазмидной ДНК по одинаковым «липким концам» (как уже было сказано выше).

Полученная гибридная (или химерная) плазмида будет представлять собой рекомбинантную ДНК. Гибридная плазмида может существовать в бактериальной клетке долгое время. Она реплицируется так же, как и исходная плазмида. Обычно встроенная чужеродная ДНК не влияет на свойства бактерий.

Единственные известные в природе эукариотические плазмиды обнаружены у дрожжей. В генной инженерии были «сконструированы» особые плазмиды, способные существовать в клетках как бактерии E. Coli, так и дрожжей Saccharomyces cerevisiae. В этом случае один и тот же вектор может быть использован с двумя хозяевами.

Явление переноса генетической информации при помощи вирусов называется трансдукцией и встречается в живой природе.

В генной инженерии наиболее широко применяется фаг ƛ. ДНК фага представляет собой линейную молекулу, поэтому один разрыв рестриктазой приводит к образованию двух фрагментов. Эти фрагменты сшивают с чужеродной ДНК, в результате чего образуется химерный фаг. Этот фаг должен пройти цикл литической инфекции для накопления достаточного количества встроенной ДНК.

Размер встраиваемой ДНК не должен превышать 10 % генома фага, иначе он не поместится в капсид. Для решения этой проблемы у фага-вектора удаляют часть собственной ДНК, оставляя только необходимые гены.

В последнее время разработаны тонкие методы введения экзогенной ДНК в клетки-реципиенты при помощи микроинъекций.

Экспрессия чужеродного генетического материала в клетке-реципиенте представлялась наиболее трудной задачей на заре становления генной инженерии.

Накопление  необходимого количества ДНК, при использовании как вирусных, так и плазмидных векторов происходит в бактериальной клетке-хозяине. Обычно эукариотические гены в бактериальной клетке не экспрессируются. Для преодоления этого барьера разработаны различные подходы.

 В последние годы большое значение приобрел новый метод – полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющий размножить любой интересующий исследователя фрагмент ДНК. Для этого используются специфические праймеры (затравки) длиной 18-20 нуклеотидов и термостойкие ДНК-полимеразы. ПЦР позволяет увеличить количество ДНК любого участка в сотни раз.

Для транскрипции эукариотического гена в бактериальной клетке он должен быть помещен под контроль бактериального промотора. Это достигается встраиванием либо кодирующей последовательности эукариотического гена в структуру оперона (причем рядом с промотором), либо бактериального промотора в вектор.

Для трансляции синтезированной чужеродной м-РНК были сконструированы векторы, в которых сайт рестрикции находится рядом с участком  связывания  рибосомы (за промотором), а вставка начинается со стартового кодона.

При трансформации эукариот посредством ДНК бактерий необходимо учитывать, что репликаторы бактериальной клетки в эукариотической клетке не работают. Для преодоления этого барьера введенная ДНК должна быть интегрирована с хромосомой, что значительно легче осуществить у микроорганизмов. Хорошую модель такого процесса мы можем наблюдать в природе. Было показано, что причиной опухолей некоторых растений является бактериальная Ti-плазмида длиной около 200 000 п. н. Эти плазмиды проникают в клетки растений, часть ДНК Тi-плазмuды (Т-ДНК) встраивается в хромосомы растений и вызывает образование опухолей, нарушая баланс фитогормонов. С помощью Тi-плазмиды были проведены различные эксперименты на растениях.

В настоящее время многие барьеры, препятствующие первым исследованиям, преодолены. В бактериальном геноме экспрессируются введенные гены человека (инсулина, интерферона, гормона роста и др.). Успешно вводятся чужие гены, в том числе и человека, в геномы животных. Чужеродный ген, введенный в клетку какого-либо организма, получил название трансгена. Животных, носителей такого гена, называют трансгенными. Генная инженерия породила целую новую индустрию - биотехнологию.[3]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4 ПРИМЕНЕНИЕ В  МЕДИЦИНЕ

 

4.1 Генная терапия

 

Успешное развитие генного анализа делает возможным применение генных методов в лечении болезней – генной терапии. Медицинские генетики получают возможность изменять гены, ответственные за некоторые наследуемые заболевания и нарушения, вставлять вместо дефектных генов здоровые. Новые гены позволят задействованным клеткам функционировать правильно.[5]

Необходимо различать 2 цели генной терапии - коррекцию генетических дефектов в соматических клетках и коррекцию их в гаметах или на самых ранних стадиях развития зиготы.

В настоящее время единственными клетками человека, которые можно использовать для переноса генов, являются клетки костного мозга или фибробласты. Эти клетки можно извлечь из организма, вырастить в культуре, перенести в них нужный ген и снова ввести пациенту. Наиболее перспективным является перенос нужных генов, связанный с использованием ретровирусов. Чтобы применять на практике методы генной инженерии, нужно быть уверенным в их безопасности. Например, человеческие онкогены по структуре отчасти гомологичны ретровирусам и при заражении клеток такими вирусами возможна их модификация и превращение в онкогены.

В экспериментах на мышах проведена генная терапия на уровне зиготы: в оплодотворенные яйцеклетки мышей карликовой линии вводили гены гормона роста крыс. При этом часть потомков (6 из 41) достигли гигантских размеров. Очевидно, что вновь встроенные гены не подвергаются нормальной регуляции, так как не удается внедрить их в места обычной локализации в хромосоме. Встраивание происходит в случайном порядке и в некоторых опытах это вызывало у мышей-реципиентов серьезные нарушения (мутации) работы нормальных генов в участках встраивания. По мнению большинства медицинских генетиков, метод генной терапии не следует в обозримом будущем применять к оплодотворенным клеткам человека, так как слишком велика опасность изменения генетической конституции человека.[2]

4.2 Биотехнология гормонов

 

В качестве примера можно взять производство рекомбинантного инсулина.

На первом месте по объему производства и стоимости продукции рекомбинантного белка как лекарственного средства находится хорошо известный гормон - инсулин, контролирующий уровень глюкозы в крови. Промышленное производство рекомбинантного инсулина было впервые начато в 1982 г. В настоящее время его годовой оборот составляет около одной трети общего оборота всех рекомбинантных белков, используемых в медицине.

Инсулин состоит из двух полипептидных цепей. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, а цепь В - 30 аминокислотных остатков. Между собой цепи А и В связаны двумя дисульфидными ( - s - s -) связями. Еще одна такая связь имеется между остатками цистеина, находящимися в А-цепи. Общая стереоструктура молекулы поддерживается этими тремя дисульфидными связями, и любое изменение в ней ведет к исчезновению гормональной активности инсулина.

Традиционный источник инсулина - поджелудочные железы сельскохозяйственных животных - свиней и крупного рогатого скота. Но используется не вся железа, а лишь ткань так называемых «островков Лангерганса».

Российский рынок ежегодно потребляет примерно одну тонну инсулина. Подсчитано, что для получения такого количества инсулина требуется приблизительно 35 млн. голов свиней. Известно также, что количество лиц, нуждающихся в систематическом введении инсулина, ежегодно возрастает на несколько процентов, поэтому проблема дефицита сырья применительно к инсулину животного происхождения существует до сих пор.

Однако не только этим обстоятельством обусловлен интерес к рекомбинантному инсулину, получаемому путем микробиологического синтеза. Инсулин, выделяемый из поджелудочной железы свиней, отличается от инсулина человека на один аминокислотный остаток. Инсулин крупного рогатого скота - на три. Это означает, что при введении их человеку он получает белок (полипептид) иной видоспецифичности. Следовательно, существует определенный процент случаев проявления аллергии. Также при парентеральном введении (особенно у детей) может наблюдаться болезненность. Одновременно приходится сталкиваться с проблемой передозирования, поскольку в случае аллергии инсулин (как антиген) частично нейтрализуется и, соответственно, вводить его необходимо больше.

Кроме того, предшественник инсулина при его биосинтезе в животной ткани, так называемый проинсулин, содержит еще одну полипептидную цепь (пептид С). Позднее эта цепь отделяется от зрелой (завершенной) формы гормона, однако при выделении инсулина из животных клеток от примеси проинсулина избавиться трудно. Как раз в пептиде С видовые различия аминокислотной последовательности гораздо более велики (по сравнению с самим инсулином), т. е. побочные эффекты инсулина животного происхождения в значительной степени обусловлены «чужим» пептидом.

Рекомбинантный инсулин, синтезируемый в микробной клетке, лишен указанных недостатков, поскольку аминокислотная последовательность двух его цепей кодируется генами человека. В принципе, он идентичен инсулину из человеческой ткани. Правда, его выделение и очистка требуют особой тщательности, так как в этом случае необходимо освобождаться от микробных липо- и гликопротеинов. Их примеси в рекомбинантном инсулине вследствие токсичности могут вызвать нежелательные побочные эффекты. Однако это уже относится к качеству отдельных серий препарата и культуре производства на данном предприятии.

В настоящее время в производстве рекомбинантного инсулина конкурируют две принципиально разные технологии. Согласно первой в клетки микроорганизма-хозяина вводят плазм иду, содержащую последовательность нуклеотидов, соответствующую проинсулину (цепи А С-пептиду, цепи В и далее лидерному пептиду и промоторному участку). В дальнейшем С-пептид отделяется. Особенность второй - раздельное получение цепи А и цепи В в двух микробных культурах, которые впоследствии объединяются.

В лабораториях одной из зарубежных фирм разработана схема получения рекомбинантного инсулина, основанная на раздельном биосинтезе двух его цепей; каждая цепь синтезируется в отдельной культуре Е. coli. Предварительно на основе плазмид конструировались векторы (один - для гена цепи А, другой - для гена цепи В). К каждой последовательности присоединялся триплет, соответствующий метионину и нуклеотидам гена индуцибельного фермента бетагалактозидазы, включая оперон. Таким образом, между нуклеотидными последовательностями цепей А, В и бетагалактозидазой оказывался метиониновый триплет. Это обстоятельство является очень важным для завершающей стадии работы. Ферментация двух культур с вектором, несущим цепь А, и вектором, несущим цепь В, проводилась на среде с лактозой (индуктором синтеза бетагалактозидазы). Если не расщепить глюкозу, то она может быть использована организмом как источник энергии. Поскольку бетагалактозидаза и цепь А (или В) имели в векторе общий промотор, накопление бетагалактозидазы сопровождалось накоплением больших количеств связанной с ней цепи А (В). По окончании ферментации из двух культур выделялись два белка: цепь А плюс бетагалактозидаза и цепь В плюс бетагалактозидаза. Метиониновый остаток, связывающий каждую инсулино¬вую цепь с бетагалактозидазой, разрушался с помощью BrCN, а инсулиновые цепи при этом освобождались и вьщелялись.