Генотерапия и генодиагностика – новая эра новой эры

Обнажённая ДНК при внутримышечном введении способна экспрессироваться в количествах, достаточных для развития иммунного ответа на появление новых белков. Этот эффект потенциально может быть использован в целях вакцинации против определённых патогенных вирусов, однако не достаточен для большинства терапевтических целей.

Для доставки генетического материала идеальной  представляется "молекулярная машина", обладающая такими качествами как:

1. высокая степень безопасности и надёжности в сочетании с достаточной дешевизной и возможностью широкого применения;
2. способность сохранять активность при движении в русле крови в течение длительного и контролируемого времени, и при этом не распознаваться иммунной системой, не вызывать воспалительных процессов;
3. высокая избирательность взаимодействия только с клетками–мишенями;
4. достаточный объём генетической информации и высокая эффективность, при которой достигается экспрессия каждой доставляемой молекулы ДНК;
5. возможность трансформировать заданное количество клеток от нескольких процентов до заведомо гарантированной 100%–й трансформации, что особенно важно при лечении онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций;
6. возможность контролировать как интенсивность, так и время экспрессии на основе данных клинического наблюдения.

Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на физические, химические и биологические.

ФИЗИЧЕСКИЕ: микроинъекция, инъекция струёй, электропорация, замораживание–оттаивание, биобаллистика (бомбардирование клеток каплями жидкости или суспензией частичек золота с адсорбированной плазмидой).

ХИМИЧЕСКИЕ: соли некоторых  катионов, например, кальция, ДЕАЕ декстран, полилизин, липосомы.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ: вирусные векторы.

Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а её доставка в клетки–мишени разных тканей in vivo успешно решается, то другие характеристики существующих векторных систем–стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность–всё ещё нуждаются в серьёзных доработках.

Повысить эффективность  стабильной интеграции можно

1. путём совершенствования генных конструкций типа рецептор–опосредованных систем;
2. путём создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК–структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время  особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов такие мини–хромосомы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Теперь остановимся  подробнее на некоторых методах.

 

Вирусы в  качестве средств доставки генетического  материала.

Большинство используемых вирусов получены от диких штаммов, обладающих различной степенью патогенности, но утративших патогенные свойства благодаря удалению генов, ответственных за размножение и (или) сборку вирусных частиц. В клинической практике обычно используются ретровирусы и аденовирусы.

РЕТРОВИРУСЫ – это РНК–содержащие вирусы, репликация которых осуществляется через ДНК интермедиата. Генетическая информация вирусной частицы, полезный объём которой может составлять 9000 пар оснований, непосредственно внедряется в геном клетки–хозяина.

Большинство ретровирусов эффективны только для делящихся клеток. Эти вирусы не применимы для клеток мышечной или нервной ткани, клеток печени и легких. Исключение составляют векторы лентивирусов. К их числу относятся вирусы ВИЧ–инфекции, которые также могут использоваться в генной терапии.

АДЕНОВИРУСЫ – имеют  двухцепочечную ДНК и обычно позволяют  доставлять существенно больший  объём полезной генетической информации. Аденовирусы не внедряются в геном  хозяйских клеток, и в процессе деления информация элиминируется. Эти вирусы эффективны при трансфекции, особенно в отношении клеток дыхательных путей, где может быть достигнута более чем 50%–я трансфекция, что на порядок выше, чем в случае ретровирусов.

Недостатки использования  вирусов:

• инициация иммунного ответа на введение инородного белка
• реактогенность самих вирусных препаратов
• часто – отсутствие тканевой специфичности
• трудности и дороговизна массового производства
• риск опухолеродных мутаций вируса или рекомбинации активных патогенных частиц

Искусственные транспортные средства.

1.ПОЛИМЕРЫ.

Полимерные молекулы, несущие избыточный катионный заряд, могут существенно повысить эффективность  трансфекции.

Определённой активностью  обладают даже небольшие молекулы (протамин, диметилсульфоксид, производные имидазола, грамицидин, липополиамин).

Большую активность обычно проявляют синтетические полимеры (полиэтиленимин, полилизин, липополилизин  или его конъюгаты с трансферрином, асиалоорозомукоидом, неогликопротеином, галактозой, маннозой), а также природные  катионные белки (гистон Н1, галактозилированный гистон Н1, гистон Н4 в комплексе с ДНК и конъюгатом трансферрин–полилизин).

Высокая эффективность  богатых лизином пептидов и белков может быть обусловлена их сходством  со специфическими сигнальными последовательностями, ответственными за транспорт из цитоплазмы в ядро. Полисахариды и белковые лиганды, входящие в состав перечисленных выше комплексов, определяют их сродство со специфическими рецепторами на поверхности клеток.

Процессы взаимодействия таких комплексов с клетками имеет  сходство с проникновением в клетку вирусных частиц.

 

2.ЛИПОСОМЫ.

Обычно используются ДНК–липидные комплексы, содержащие плазмиду с "экспрессированной" кассетой.

Преимущества ДНК–липидных комплексов по сравнению с вирусными векторами:

• могут нести больший объём генетической информации;
• не могут приобретать инфекционных свойств вследствие рекомбинации;
• имеют более низкую вероятность инициации иммунного ответа или воспалительной реакции;
• простота и дешевизна приготовления.

Особенно перспективным  представляется использование фосфолипидов, например, кардиолипина и фосфатидилэтаноламина, образующих наряду с бислойными мембранами также инвертированные мицеллярные структуры, известные как кубические и гексагональные фазы, что определяет способность этих липидов инициировать слияние мембран. В присутствии катионов кальция или магния взаимодействие ДНК с фосфолипидами становится более прочным, липосомы агрегируют, и ДНК интернализуется во внутренний объём везикул. Использование высокомолекулярных катионных посредников, обеспечивающих формирование комплексов ДНК с фосфолипидами и взаимодействие этих комплексов с поверхностью клеток, потенциально могло бы улучшить их эффективность в трансфекции.

Революцией явилось  введение в практику первого низкотоксичного  катионного липида ДОТМА (1,2–диолеил–3–N,N,N–триметиламинопропан), синтезированного Фелгнером с соавторами. Одновременно был введён в практику новый термин "липофекция", подчёркивающий высокую эффективность генетической трансформации клеток, приближающую липосомальные препараты к инфекционным вирусным частицам.

При введении в ткани "обнажённой" ДНК обычно экспрессировалась  только одна молекула из нескольких миллионов, а ДОТМА увеличивал этот параметр примерно в 1000 раз.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Объекты генной терапии

Болезни – объекты генной терапии – могут быть разделены на две группы: наследственные и приобретенные.

Наследственные  заболевания считались основными объектами генной терапии на начальном этапе ее развития. Это, как правило, моногенные заболевания, вызванные отсутствием или недостаточной функцией одного конкретного гена. Предполагалось, что введение такому больному нормально функционирующего гена приведет к излечению болезни.

Всем хорошо известна так называемая царская болезнь – гемофилия. В основе заболевания лежит дефект в генах VIII или IX фактора свертывания крови (гемофилия типа А или типа Б). Гены этих белков выделены и отсеквенированы, сформированы разнообразные ДНК–конструкции, содержащие эти гены, которые расположены на Х–хромосоме. Последнее обстоятельство служит причиной того, что данная болезнь передается по наследству по женской линии, но страдают ею практически только мужчины.

Для лечения гемофилий  созданы ретровирусные конструкции, несущие гены факторов свертывания  крови. Было показано, что они экспрессируются  в фибробластах (соединительной ткани) кожи in vitro, однако при введении таких клеток в организм экспрессия оказывалась временной, что, по всей видимости, обусловлено отсутствием специфических промоторов, которые могли бы обеспечить постоянную работу трансгенов. Успех в лечении гемофилии был достигнут путем введения гена фактора IX свертывания крови; ген фактора VIII менее эффективен. Продемонстрирована продолжительная частичная коррекция гемофилии на моделях мышей и собак, и в 1999 г. начаты клинические работы по лечению гемофилии у человека.

Еще одно широко известное  моногенное заболевание – миодистрофия Дюшенна – тоже связано с Х–хромосомой. Оно обусловлено дефектом в гене дистрофина. Больные мальчики к десятилетнему возрасту обездвиживаются и в последующее десятилетие наступает неизбежная смерть от нарастающей слабости сердечной и легочной мускулатуры.

Возможность генной терапии  миодистрофий изучается уже почти 15 лет. Ген дистрофина выделен, клонирован и секвенирован, и на его базе созданы разнообразные генные конструкции. На модели мышей mdx, лишенных гена дистрофина, продемонстрирована возможность получения трансгенных животных, синтезирующих в мышцах нормальный ген, что привело к нормализации функции мышц. Описан ряд достаточно успешных попыток введения этого гена или его мини–вариантов взрослым животным, причем использовались различные подходы, включая целевую доставку путем баллистической трансфекции. В удачных случаях интродуцированный ген дистрофина экспрессировался в значительной массе мышечных волокон (до 25%). Однако генная терапия миодистрофий сталкивается с принципиальной трудностью: необходима генетическая модификация большинства (до 50%) мышечных волокон, разбросанных по всему организму, что требует узконаправленного и высокоэффективного метода переноса генов. Можно надеяться, что эта трудность будет преодолена с помощью высокоэффективных вирусных конструкций нового поколения, возможно, в комбинации с различными методами доставки, включая использование синтетических микросфер.

Основное внимание, судя по числу клинических протоколов, генная терапия моногенных заболеваний уделяет лечению муковисцедоза. Эта болезнь, поражающая примерно одного из 2500 новорожденных в Центральной Европе, вызывается наследственным дефектом гена, ответственного за перенос ионов через клеточную мембрану. Наличие двух дефектных аллелей гена приводит к развитию хронических легочных инфекций и неспособности нормально адсорбировать питательные вещества из пищеварительного тракта. Введение в дефектные клетки in vivo нормального гена муковисцедоза с помощью рекомбинантных аденовирусных векторов или липосом позволяет корректировать биохимический дефект без существенной токсичности. Уже начаты испытания этого подхода. Ген в легкие пациента вводится при вдыхании водно–эмульсионного препарата. Правда, на первом этапе испытания не дали положительного результата, однако применение липосом и катионных липидов дает надежду на успех.

 

 

 

Ненаследственные  заболевания не связаны с врожденным дефектом в структуре и функции одного определенного гена. Генная терапия этих заболеваний базируется на предположении, что введенный в организм "лечебный ген" приводит к синтезу белка, оказывающего терапевтический эффект. Альтернативная схема основана на изменении свойств трансфицированных клеток, что вызывает лечебный эффект сам по себе или же делает эти клетки чувствительными к действию лекарственных препаратов.

Перечень наиболее распространенных приобретенных заболеваний – объектов генной терапии – насчитывает, по крайней мере, три десятка. Рассмотрим несколько конкретных примеров.

Сердечно–сосудистая система. Эта быстро растущая область генной терапии развивается в нескольких направлениях.

Первое – предотвращение тромбообразования. Основная идея – генетическая модификация эндотелия кровеносных сосудов под действием генов, продукты которых могут предотвращать формирование тромбов (например, ген тканевого активатора плазминогена). К сосудистому эндотелию гены можно доставлять через катетер, введенный в кровеносный сосуд.

Второе направление – восстановление сосудистой системы сердечной мышцы после инфаркта миокарда путем введения генов, продукты которых индуцируют процесс сосудообразования (гены ангиогенеза). И наконец, профилактика и лечение атеросклероза благодаря введению генов, ответственных за синтез липопротеидов высокой плотности, которые необходимы для нормального процесса обмена жировых компонентов крови. Разрабатывается также генно–терапевтический подход к лечению атеросклеротических изменений сосудов путем предотвращения разрастания и миграции гладкомышечных клеток сосудистой стенки. С этой целью в них вводятся соответствующие гены – супрессоры пролиферации.