Животная клетка – объект биотехнологии

К. Келер и Ц. Милынтейн в 1975 г. смогли впервые получить соматические гибриды клеток млекопитающих — гибридомы, продуцирующие так называемые моноклональные антитела. В иммунном организме антитела образуются плазматическими клетками, возникающими в результате дифференциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию. В-лимфоциты — высоко специализированные клетки, их в организме порядка 10⁷ клонов и каждый клон синтезирует антитела только одной специфичности — моноклональные антитела (вариантов антител может быть также 10⁷⁾. Если антиген содержит несколько специфических (детерминантных) групп, то антитела образуются против каждой детерминанты. В-лимфоциты не удается поддерживать в культуре.

Если В-лимфоцит перерождается  и трансформируется in vivo в злокачественную опухоль, то такая опухоль — миелома синтезирует большое количество антител. Однако возникают и такие варианты миеломных клеток, в которых отсутствует экспрессия генов в отношении синтеза тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Миеломные клетки могут поддерживаться в культуре неопределенно долго. Совместив способность миелом к длительному культивированию в условиях in vitro и способность В-клеток продуцировать моноклональные антитела, Келер и Мильштейн получили гибрид, секретирующий моноклональные антитела. Для этих целей они использовали мышиные клетки миеломы и нормальные В-клетки селезенки мыши, иммунизированной заданным антигеном. Подобные гибридомы широко используются теперь для получения различного рода моноклональных антител, применяемых в диагностических, лечебных и других целях.

Необходимо иметь в  виду, что, в отличие от половой  гибридизации, соматическая гибридизация эукариотических клеток завершается объединением под одной мембраной не только ядерных геномов двух (или более) особей, но и генов цитоплазмы (митохондриальных емкостью в 1000—2000 генов), что может отразиться на функциональной активности гибрида. У межвидовых гибридов часть хромосом может утрачиваться за счет элиминации, которая оказывается видоспецифичной. Так в гибридах протопластов клеток "мышь х человек" и "человек х комар" элиминируются хромосомы человека и комара соответственно. При морфологическом различии хромосом такие гибриды удобны для картирования генов. Напомним, что в соматических клетках мыши содержится 20 пар хромосом, в клетках человека 23 пары хромосом и три пары — в диплоидных клетках комара.

Таким образом, на практике стремятся осуществлять соматическую гибридизацию для заметного расширения рамок скрещивания, для включения (переноса) внеядерных генов и их функций в гибридное потомство и для локализации генов в хромосомах.

В случае переноса изолированных  хромосом от клетки-донора одного организма  в клетку-реципиент другого организма  говорят о хромосомной инженерии. О. Мак Брайд и X. Озер впервые в 1973г. осуществили такой перенос хромосом (в стадии метафазы) китайского хомячка в клетки мыши.

Хромосомная инженерия —  ветвь генетической инженерии. Объектами  ее являются хромосомы клеток прокариот  и эукариот. Донорами хромосом могут  быть различные суспензионные и  субстрат-зависимые клеточные линии. Из клеток прокариот хромосому (ДНК) выделяют из супернатанта после центрифугирования дезинтеграта или лизата клеток (протопластов). Клетки эукариот блокируют на стадии мейоза, хромосомы выделяют, применяя "гипотонический шок" и гомогенизацию с последующей очисткой их дифференциальным центрифугированием. Хромосомы осаждают на поверхности реципиентных клеток хлоридом кальция и через несколько часов клетки обрабатывают реагентом — "перфоратором" (например, глицерином). Реципиентные клетки могут содержать донорный материал в широком диапазоне (встроенным в геном, изолированно).

Благодаря хромосомной инженерии  стали возможными получение высокомолекулярных БАБ, присущих человеку, лечение наследственных заболеваний, селекция пород домашних животных и различных видов растений.

Естественное или искусственное  скрещивание растений и животных, когда происходит оплодотворение женской гаметы мужской, по сути своей касается переноса и слияния хромосом с последующим возникновением жизнеспособных гибридов. Межвидовое скрещивание как правило сопровождается худшими результатами — получаемые гибриды обладают сниженной плодовитостью или могут быть совершенно бесплодными.

Целые наборы хромосом от разных видов могут соединяться вместе и в результате возникают аллополиплоидные формы (от греч. alios — другой). Можно соединять и неполные хромосомные наборы.

При искусственном скрещивании  растений или животных стремятся  получать в потомстве комбинацию различных ценных родительских признаков.

Теоретически любые клетки могут быть использованы либо в качестве донора хромосом, либо в качестве реципиента их, хотя на практике стремятся иметь  подходящие реципиентные линии клеток, акцептирующие чужеродную ДНК с повышенной активностью, например, клетки карциномы мочевого пузыря человека.

Генно-инженерные разработки в области зообиотехнологии (в частности_, с соматотропином, или гормоном роста) оказались важными для животноводства (возрастание привесов животных, лактации). Используя метод микроинъекций рДНК в зародышевые клетки млекопитающих (в пронуклеусы оплодотворенных ооцитов, или в яйцеклетки) удается получать так называемых трансгенных животных. Клоны реципиентных клеток, содержащие донорный хромосомный материал, или трансгены, различаются по количеству его в широком диапазоне, и если функциональная активность и регуляция экспрессии клонированных генов изучаются на целом организме, то и говорят о трансгенном организме.

С получением трансгенных животных открываются перспективы развертывания заманчивых исследований на рубеже XX и XXI вв. Уже сегодня имеется информация о том, что в Эдинбурге (Великобритания) есть стадо овец, несущих гены человека, индуцирующие выработку факторов свертываемости крови (борьба с гемофилией у человека благодаря, например, использованию в пищу овечьего молока, где содержались бы такие факторы); удалось ввести ген гормона роста крупнорогатых животных в геном клеток поросят, заставили расти их быстрее и с меньшим количеством жира. Однако подобные результаты, очевидно, будут сопряжены и с неудачами. Необходимы кропотливые исследования во всех направлениях генетической инженерии, чтобы добиться успехов в практическом воплощении наиболее приемлемых результатов в биологическую технологию.

Стволовые клетки

Стволовы́е кле́тки — недифференцированные (незрелые) клетки, имеющиеся во всех многоклеточны организмах. Стволовые клетки способны самообновляться, образуя новые стволовые клетки, делиться посредством митоза и дифференцироваться в специализированные клетки, то есть превращаться в клетки различных органов и тканей.

Развитие многоклеточных организмов начинается с одной стволовой  клетки. В результате многочисленных циклов деления и процесса дифференцировки образуются все виды клеток, характерные для данного биологического вида. В человеческом организме таких видов клеток более 220. Стволовые клетки сохраняются и функционируют и во взрослом организме, благодаря им может осуществляться обновление и восстановление тканей и органов. Тем не менее, в процессе старения организма их количество уменьшается.

В современной медицине стволовые клетки человека трансплантируют, то есть пересаживают в лечебных целях. Например, трансплантация гемопоэтических стволовых клеток производится для восстановления процесса гемопоэза (кроветворения) при лечении лейкозов и лимфом.

Характеристика стволовых клеток

Все стволовые клетки обладаю двумя  неотъемлемыми свойствами:

• Самообновление, то есть способность сохранять неизменный фенотип после деления (без дифференцировки).
• Потентность (дифференцирующий потенциал), или способность давать потомство в виде специализированных типов клеток.

Существуют два механизма, поддерживающих популяцию стволовых клеток в организме:

1. Асимметричное деление, при котором продуцируется одна и та же пара клеток (одна стволовая клетка и одна дифференцированная клетка).
2. Стохастическое деление: одна стволовая клетка делится на две более специализированных.

Дифференцирующий потенциал, или  потентность, стволовых клеток — это способность производить определенное количество разных типов клеток. В соответствии с потентностью стволовые клетки делятся на следующие группы:

• Тотипотентные (омнипотентные) стволовые клетки могут дифференцироваться в клетки эмбриональных и экстраэмбриональных тканей, организованные в виде трехмерных связанных структур (тканей, органов, систем органов, организма). Такие клетки могут дать начало полноценному жизнеспособному организму. К ним относится оплодотворённая яйцеклетка, или зигота. Клетки, образованные при первых нескольких циклах деления зиготы, также являются тотипотентными у большинства биологических видов. Однако к ним не относятся, например, круглые черви, зигота которых утрачивает тотипотентность при первом делении. У некоторых организмов дифференцированные клетки также могут обретать тотипотентность.
• Плюрипотентные стволовые клетки являются потомками тотипотентных и могут давать начало практически всем тканям и органам, за исключением экстраэмбриональных тканей (например, плаценты). Из этих стволовых клеток развиваются три зародышевых листка: эктодерма, мезодерма и энтодерма.
• Мультипотентные стволовые клетки порождают клетки разных тканей, но многообразие их видов ограничено пределами одного зародышевого листка.

Эктодерма даёт начало нервной системе, органам чувств, переднему и заднему отделам кишечной трубки, кожному эпителию. Из мезодермы формируются хрящевой и костный скелет, кровеносные сосуды, почки и мышцы. Из энтодермы — в зависимости от биологического вида — образуются различные органы, ответственные за дыхание и пищеварение. У человека это — слизистая оболочка кишечника, а также печень, поджелудочная железа и лёгкие.

• Олигопотентные клетки могут дифференцироваться лишь в некоторые, близкие по свойствам, типы клеток. К ним, например, относятся клетки лимфоидного и миелоидного рядов, участвующие в процессе кроветворения.
• Унипотентные клетки (клетки-предшественницы, бластные клетки) — незрелые клетки, которые, строго говоря, уже не являются стволовыми, так как могут производить лишь один тип клеток. Они способны к многократному самовоспроизведению, что делает их долговременным источником клеток одного конкретного типа и отличает от нестволовых. Однако их способность к самовоспроизведению ограничена определённым количеством делений, что также отличает их от истинно стволовых клеток. К клеткам-предшественницам относятся, к примеру, некоторые из миосателлитоцитов, участвующих в образовании скелетной и мышечной тканей.

Виды стволовых клеток

Стволовые клетки можно разделить  на три основные группы в зависимости  от источника их получения: эмбриональные, фетальные и постнатальные (стволовые  клетки взрослого организма).

Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) образуют внутреннюю клеточную массу (ВКМ), или эмбриобласт, на ранней стадии развития эмбриона. Они являются плюрипотентными. Важный плюс ЭСК состоит в том, что они не экспрессируют HLA (human leucocyte antigens), то есть не вырабатывают антигены тканевой совместимости. Каждый человек обладает уникальным набором этих антигенов, и их несовпадение у донора и реципиента является важнейшей причиной несовместимости при трансплантации. Соответственно, шанс того, что донорские эмбриональные клетки будут отторгнуты организмом реципиента очень невысок. При пересадке иммунодефицитным животным эмбриональные стволовые клетки способны образовывать опухоли сложного (многотканевого) строения — тератомы, некоторые из них могут стать злокачественными. Достоверных данных, о том как ведут себя эти клетки в иммунокомпетентном организме, например, в организме человека, нет. Вместе с тем, следует отметить, что клинические испытания с применением дифференцированных дериватов (производных клеток) ЭСК уже начаты. Для получения ЭСК в лабораторных условиях приходится разрушать бластоцисту, чтобы выделить ВКМ, то есть разрушать эмбрион. Поэтому исследователи предпочитают работать не с эмбрионами непосредственно, а с готовыми, ранее выделенными линиями ЭСК.

Клинические исследования с использованием ЭСК подвергаются особой этической экспертизе. Во многих странах исследования ЭСК ограничены законодательством.

Одним из главных недостатков ЭСК  является невозможность использования  аутогенного, то есть собственного материала, при трансплантации, поскольку выделение  ЭСК из эмбриона несовместимо с его  дальнейшим развитием.

Фетальные стволовые клетки

Фетальные стволовые клетки получают из плодного материала после аборта (обычно срок гестации, то есть внутриутробного развития плода, составляет 9—12 недель). Естественно, изучение и использование такого биоматериала также порождает этические проблемы. В некоторых странах, например, на Украине и в Великобритании, продолжаются работы по их изучению и клиническому применению. К примеру, британская компания ReNeuron исследует возможности использования фетальных стволовых клеток для терапии инсульта. Эти клетки уже начали дифференцировку, и, следовательно, каждая из них, во-первых, может пройти только ограниченное число делений, и, во-вторых, дать начало не любым, а достаточно определенным видам специализированных клеток. Так, из клеток фетальной печени могут развиться специализированные клетки печени и кроветворные клетки. Из фетальной нервной ткани, соответственно, развиваются более специализированные нервные клетки.