Лекции по "Биотехнологии"

 

 

ЛЕКЦИЯ № 5

БИОКАТАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ ЛИПАЗ

Исследования биокаталитических систем на основе липаз являются важными и актуальными как по фундаментальной, так и по прикладной направленности. Липазы – это сериновые гидролазы, катализирующие ряд ключевых биохимических реакций: гидролиз, этерификация, трансэтерификация, алкоголиз, ацидолиз Липазы применяются в пищевой, фармакологической, агрохимической и кожевенной промышленности, в производстве моющих средств, поверхностно и оптически активных соединений, вкусовых и ароматических компонентов, для аналитических целей в медицине. Свойство энантиоселективности липаз широко применяется в органическом синтезе биологически активных веществ и их синтетических аналогов, таких как простагландины, алкалоиды, терпеноиды, антибиотики, производные нуклеозидов и т.п.

Однако дальнейшее применение липаз в промышленности сдерживается сложностями в создании оптимальной реакционной системы, высокой ценой ферментов, загрязненностью большинства ферментных препаратов, низкой термостабильностью, невысокими скоростями реакций и т.д. Решения большинства вышеперечисленных проблем лежат на пути использования иммобилизованных ферментов. Иммобилизация липаз способствует отделению фермента от продуктов реакции, позволяет экономить фермент, увеличивает термостабильность и активность липаз. В настоящее время накоплен обширный материал по иммобилизации липаз из различных источников методами адсорбции, ковалентного связывания, включения в полимерные гели и т.д. [Мосбах К., 1976; Березин И.В. и др., 1987; Кабанов В.А. и др., 1987; Вудворд Дж., 1988; Варфаломеев С.С. и др., 1999; Штильман М.И., 2006 и другие]. Однако, систематизированных данных о влиянии полимеров на коллоидно-химические и каталитические свойства липаз из различных источников до начала наших работ в литературе было недостаточно. При исследовании новых биоматериалов и методов иммобилизации важно проводить фундаментальную работу по изучению физико-химических свойств иммобилизованных липаз.

Показана возможность использования липазы для обессмоливания лиственной химико-механической массы и лиственной сульфатной целлюлозы. Установлено снижение активности фермента в присутствии сульфатной целлюлозы вследствие сорбции липазы на волокно.

 

РАЗРАБОТКА ЭФФЕКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПАЗ И НОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

В наши дни в высокоэффективных биотехнологических процессах по переработке пищевого сырья широко применяются различные ферментные препараты на основе липаз. Новые требования диетологии обусловливают необходимость биохимической трансформации жиров с целью повышения пищевой ценности животных жиров и их усвояемости.

Усвояемость и пищевая ценность жира определяется составом его жирных кислот (ЖК), а именно, содержанием незаменимых ненасыщенных жирных кислот (НЖК) и, в первую очередь, полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) — -линоленовой и арахидоновой (по структуре молекулы относятся к классу так называемых -6-НЖК), а также -линоленовой, эйкозапентаеновой и докозагексаеновой ( -3-НЖК). Эти ПНЖК служат предшественниками целого ряда важнейших физиологически активных регуляторов — простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Их присутствие в рационе имеет первоочередное профилактическое и терапевтическое значение. С учетом важности включения ПНЖК разных классов в состав потребляемых жиров, основная стратегия биохимической переработки заключается в получении -3- и -6-НЖК или их легко усвояемых производных для последующего добавления в пищевые композиции, синтеза эфиров определенного состава на их основе или их переэтерификации с использованием липаз разного происхождения.

Активные продуценты липаз принадлежат к различным группам микроорганизмов: это бактерии из родов Pseudomonas, Bacillus, актиномицеты Streptomyces и Thermoactinomyces, дрожжи (в основном, представители рода Candida — C. rugosa, C. lipolytica, C. antarctica). Однако в пищевой промышленности самое активное применение находят ферменты мицелиальных грибов Rhizopus, Aspergillus, Penicillium, Rhizomucor, Mucor, Humi-cola, Geotrichum. В последнее время все чаще используются рекомбинантные штаммы, позволяющие получать высокий уровень продукции липаз с заданными свойствами.

Новые методы модификации жиров

Широкие перспективы применения ферментных препаратов липаз при получении специальных жиров, предназначенных для кондитерской, хлебопекарной, молочной и других отраслей промышленности, открывают методы модификации жиров путем этерификации и переэтерификации. В этих процессах используют те же ферменты, что и для гидролиза жиров, однако технологическое оформление существенно отличается. В среду вводится этерифицирующий компонент, ее состав оптимизируется для смещения направления реакции в сторону синтеза и переэтерификации липидов главным образом за счет снижения содержания воды. Кроме того, эффективность процесса значительно возрастает при использовании иммобилизованных ферментов.

В настоящее время разработано несколько технологий ферментативной этерификации, осуществляемой в смеси глицерина и концентрата НЖК в присутствии различных микробных липаз. Наиболее эффективный выход триглицеридов отмечен при использовании ферментов из Candida antarctica, C. rugosa, Rhizopus sp. и Rhizomucor miechei.

Более распространенный процесс переэтерификации обычно проводят с помощью специфичной липазы (активной в отношении только 1,3-положений триглицерида) с сохранением во втором положении триглицерида природной жирной кислоты (как правило, именно во втором положении находится наименее насыщенная кислота). В результате такой обработки в присутствии липаз происходит преимущественное высвобождение из жиросодержащего сырья жирных предельных кислот. Переэтерификация животных жиров позволяет существенно снижать содержание биологически малоценных остатков стеариновой и пальмитиновой кислот. Образующиеся продукты характеризуются повышенным содержанием ценных непредельных жирных кислот, т.е. происходит оптимизация всего жирнокислотного состава продукта. Такой подход позволяет получать по экологически безопасной технологии жиры с желаемыми физико-химическими и структурно-механическими показателями, а также с улучшенными вкусовыми и полезными для здоровья свойствами.

Введение ПНЖК в составе жиров в детские питательные смеси сейчас получает все большее распространение. Это заменитель молочного жира, кондитерские (масло какао) и хлебопекарные жиры. Такие продукты называют «функциональные жиры». Исходным сырьем для производства вышеупомянутых жиров служат тропические масла и их фракции (пальмовый стеарин, пальмовый олеин, пальмоядровое масло, кокосовое масло), а также различные жидкие масла (подсолнечное, рапсовое или соевое).

 

В качестве источника НЖК используют различные растительные масла (подсолнечное, пальмовое, соевое, кукурузное, рапсовое), -3 ПНЖК — рыбий и тюлений жир, -6 ПНЖК — животный ливер, в некоторых странах (например, в Японии) — биомасса микроскопических грибов Mortierella, накапливающих липиды с содержанием арахидоновой кислоты до 70%. Объектом для переэтерификации служат различные животные жиры и молочный жир. С учетом кинетических особенностей процесса оптимальными считают липазы Rhizopus (R. japonicus и R. delemar), Pseudomonas и Rhizomucor miechei. Наиболее перспективным направлением в современной масложировой технологии признана концепция совместного использования процессов гидрирования и переэтерификации жиров с целью значительного повышения качества маргариновой продукции.

Ферментные препараты липаз в больших объемах применяют сегодня в мукомольной и хлебопекарной промышленности. Практикуется внесение в муку и тесто разных групп ферментных хлебопекарных комплексов, обеспечивающих достижение таких целей, как возможность переработки муки с нестабильными хлебопекарными свойствами, формирование определенных реологических свойств теста, улучшение качества хлебобулочных изделий разнообразного ассортимента (сдобных, слоеных дрожжевых и бездрожжевых изделий, изделий, приготовленных на основе замороженных полуфабрикатов), стабилизация качества и продление срока сохранения свежести хлеба. Обоснованиями для использования липаз служат повышение биологической активности гидролизуемого субстрата, а также то, что промежуточные продукты гидролиза масел и жиров (моно- и диглицериды), обладая поверхностно-активными свойствами, оказывают улучшающее действие на свойства клейковины, полуфабрикаты и готовую продукцию.

 

Новое поколение генно-инженерных продуцентов липаз

Сегодня группа специалистов из Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под руководством профессора Сергея Синеокого занимается разработкой основ ферментативной переэтерификации жиров с введением в их состав арахидоновой кислоты. Получаемый продукт предназначен в основном для детского и диетического питания, в первую очередь для людей с нарушенным синтезом ПНЖК: пожилых людей, больных диабетом, артритом и др.

Исследователи предлагают для повышения уровня активности микробных продуцентов липаз в целях скорейшего обеспечения конкурентоспособности этого производства в России максимально полно использовать имеющиеся возможности селекции существующих промышленных грибных штаммов продуцентов Rhizopus с одновременным созданием на их основе нового поколения генно-инженерных продуцентов липаз. Генно-инженерные грибные продуценты специалисты планируют создавать с использованием системы клонирования в штаммах R.oryzae. По словам руководителя проекта, «развитие генно-инженерных подходов создания продуцентов липаз позволит выйти на современный уровень работ в этой области и заложить основы для конструирования широкого спектра высокоактивных продуцентов разнообразных промышленно-ценных липаз».

Главная цель проекта — разработка эффективных продуцентов липаз с последующей организацией масштабного производства ферментов для замены импортных и развития ферментных технологий в масложировой промышленности России. Основной задачей авторский коллектив считает отбор и конструирование нового поколения высокоэффективных микробных продуцентов липаз для ферментных препаратов с заданными свойствами. Планируется также создание основ технологии получения новых продуктов ферментативной переэтерификации жиров, содержащих ценные полиненасыщенные жирные кислоты.

Специалисты из Института генетики и селекции промышленных микроорганизмов в течение ряда лет занимались скринингом грибных продуцентов липаз, селекцией штаммов с повышенной липазной активностью, в т.ч. на основе штаммов гриба R.orуzae. В последние годы ученые активно ведут работы по созданию новых перспективных систем клонирования в клетках R.orуzae, одного из наиболее эффективных промышленных продуцентов липаз. В институте имеются активные штаммы Rhizopus orуzae, продуцирующие липазы с ценными для пищевой промышленности свойствами. Создание новых грибных генно-инженерных продуцентов липаз открывает широкие возможности дальнейших работ по направленному изменению свойств липаз для решения разнообразных прикладных задач.

Институт имеет тесные связи с биотехнологическими заводами, производящими ферментные препараты, а также с предприятиями пищевой промышленности, осуществляющими переработку пищевых продуктов с использованием технологий, основанных на использовании липаз.

В ходе проекта исследователи планируют повысить липазную активность существующих штаммов Rhizopus путем использования имеющихся селекционных и генно-инженерных подходов до уровней, обеспечивающих конкурентоспособность штаммов продуцентов и высокую рентабельность биотехнологического процесса производства ферментов. В ходе генно-инженерных работ планируется использование разрабатываемой в институте новой системы клонирования в клетках грибов Rhizopus, созданных в ходе этих работ векторов и систем селекции трансформантов. Специалисты полагают, что амплификация собственного гена липазы и его экспрессия под эффективными грибными промоторами в геноме гриба приведет к существенному повышению уровня синтеза фермента.

В ходе работ планируется также проведение отработки ферментационного процесса и оценки эффективности использования полученных ферментов для гидролиза липидов и переэтерификации жиров, в т.ч. включения в их состав полиненасыщенной арахидоновой кислоты. Эти этапы планируется осуществлять в тесном взаимодействии с соответствующими предприятиями биотехнологической и пищевой промышленности.

Реализация проекта должна заложить основы для дальнейшего развития работ по созданию высокоактивных продуцентов широкого спектра перспективных липаз, полученных как в результате скринингового подхода, так и путем направленного изменения свойств ферментов методами генной инженерии.