Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга

Фетнер в 1956 году  изучал на микроспорах традесканции влияние кислорода на возникновение делеций и перекомбинаций фрагментов (дицентрические и трицентрические хромосомы, центрические кольца). При облучении дозами 200 и 400 рентген наблюдалось увеличение процента как делеций, так и обменов. Автор считает, что в отсутствие кислорода происходит меньше разрывов, а возникшие фрагменты реже перекомбинируются [17].

В опытах Джайлса и его сотрудников на микроспорах традесканции было обнаружено следующее:

1) наличие кислорода приводит  к увеличению числа хромосомных  перестроек всех типов, другие  газы влияния не оказывают;

2) кислород эффективен лишь в  том случае, когда он присутствует  в клетке во время облучения. Введение его до и непосредственно  после облучения никакого эффекта  не дает. Кислород без облучения  также не эффективен (хотя в  литературе имеются данные, говорящие  о возникновении хромосомных  перестроек в хромосомах пыльцевых  зерен при действии одного кислорода;

3) даже при полном отсутствии  кислорода (поскольку таковое может  быть достигнуто в условиях  опыта) наблюдается значительное  количество перестроек. 

 

 

 

 

2.3. Факторы среды и другие неучтенные факторы 

 

В ходе мейоза возможны различные нарушения, причиной которых могут быть окружающие условия или генетические особенности  организмов.   
У растений нарушения мейоза чаще всего возникают при изменение температуры. После изучения механизма действия температуры на формирование аберраций стало ясно, что повышение температуры, как и понижение, приводит к изменению интенсивности всех физиологических процессов клетки. Очевидно, в каждом конкретном случае температурный эффект может быть различным. Есть данные , что частота аберраций у микроспор традесканции увеличивается в 4 раза при облучение их рентгеновскими лучами в условиях пониженной температуры.

Нарушения мейоза у растений могут быть вызваны и заболеваниями. Например, у растений желтого люпина, больных узколистностью ( вирусное заболевание ), отмечено появление унивалентов, отстающих хромосом и анафазных мостов. В такие же нарушения в мейозе могут возникнуть при голодании и недостатке воды в почве. 

У некоторых растений нарушения в мейозе ежегодно встречаются в больших количествах. Так, у Anemona nemorosa микроспорогенез всегда происходит при очень низкой температуре (около 0 °С) и поэтому во многих микроспороцитах в ходе мейоза имеются нарушения.   
Нарушения мейоза у растений могут быть обусловлены не только погодными условиями, но и особенностями опыления. 

В ходе процесса мейоза возможны отклонения и нарушения, которые могут быть связаны с цитогенетическими и физиологическими особенностями организмов, а также с внешними условиями. Некоторые авторы отмечают, что частота нарушений в мейозе зависит не только от температурных условий, в которых произрастают растения, но и от особенностей сорта и от их урожайности.

Некоторые отклонения от общей схемы мейоза стали нормой для ряда видов растений. Хорошо известно, что в ходе микроспорогенеза у цветковых растений, как правило, почти все микроспороциты в норме проходят мейоз, и все 4 продукта мейоза являются функционально нормальными, то есть образуют мужской гаметофит. Однако из этого правила есть исключения. У представителей некоторых родов растений (Swertia, Holoptelia, Ophiopogon, Zostera) многие потенциальные микроспороциты не проходят мейоз, а дегенерируют, по-видимому, выполняя трофическую роль, так как в пыльниках этих растений слабо развит тапетум. В этих случаях часть спорогенных клеток компенсируют недостаточность функционирования тапетума. Иногда, как у Kigelia, дегенерация происходит на стадии тетрад микроспор.

Таким образом, изучение мейоза, особенно при исследовании  природных популяций растений ограничено тем, что он чувствителен к неблагоприятным климатическим факторам, среди которых основную роль играют недостаток влаги или ее быстрое испарение и повышенная температура.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.4. Микроспорогенез как показатель в оценке действия загрязнителей среды 

 

Анализ литературных данных  показал, что микроспорогенез растений является распространенным методом биоиндикации загрязняющего воздействия среды промышленными отходами и выбросами.   
В качестве тест-объектов используются различные растения, но наиболее чувствительными являются Tradescantia sp. , Acer platanoides L. , Vicia cracca L., Vicia faba.

Группа исследователей изучили характер микроспорогенеза у растений Vicia cracca L. из нескольких районов г. Новокузнецка с различной степенью загрязнения промышленными отходами. Было показано, что уровень патологических отклонений от нормы коррелирует с условным суммарным показателем загрязнения. Наиболее значимыми критериями в оценке действия загрязнителей среды является количество аномальных мейотических клеток и стерильность пыльцы.  Стерильность пыльцы в большинстве случаев связано с нарушением правильности течения мейоза при микроспорогенезе. У растений, подвергшихся действию выхлопных газов, значительно больше стерильной пыльцы во внешние нормальных пыльниках. Типичным нарушением можно считать образование пентад, гексад и других полиад вместо тетрад вследствие неравномерного распределения хромосомного материала в анафазе. К этому же типу нарушений можно отнести наличие микроядер. 

Патологические микроспоры характеризуются неравномерной окраской цитоплазмы, плазмолизом, высокой гидрофильностью ядра и рядом других признаков, наблюдаемых при формирование пыльцевых зерен. Патологические изменения, появляющиеся на всех стадиях мейоза, значительно снижают формирование полноценной жизнеспособной пыльцы.   
Высокий процент пыльцы у растений, произрастающих в зоне продолжительных загрязнений среды, оказывается стерильной ( до 50% пыльцы ). В целом, для популяции это означает уменьшение генетического разнообразия и как следствие - снижение адаптивных возможностей.   
Анализ нарушений микроспорогенеза позволяет оценить факторы, действующие длительно, хотя и в малых дозах, и, по сути дела, включенные в микроэкологический фон популяции. Таким образом, аномальное протекание мейоза в микроспороцитах и количество стерильной пыльцы - хороший тест в системе биоиндикации загрязнителей среды[18]. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.5. Митотическая активность как показатель антропогенной нагрузки в системе цитогенетического мониторинга 

 

Митотическая активность клеток крайне  важна для нормальной жизнедеятельности организма и нередко используется исследователями в качестве чувствительного показателя в оценке загрязненности окружающей среды. По изменению митотической активности в ту или иную сторону можно судить о степени мутагенного воздействия на окружающую среду. 

Митотическая активность оценивается с помощью определения митотического индекса (МИ).  Анализ литературы позволяет сделать вывод о том, что в  большинстве случаев снижение митотического индекса в исследуемых популяциях растений  указывает на негативное влияние загрязнений окружающей среды на хромосомный аппарат [17]. Однако есть предположения, что снижение митотической активности может быть связано с интегральным эффектом природно-климатических факторов: повышение температуры, избыток или недостаток влажности. Повышение  митотического индекса связано с увеличением доли клеток на всех стадиях митоза. Такое явление наблюдается в популяциях растений, подвергающихся небольшим стрессовым воздействиям, обуславливающим стимулирующий эффект. При сильных стрессовых воздействиях, особенно мутагенной природы, наблюдается обратный эффект. 

В целом, популяции растений, произрастающие в экологически чистых условиях, имеют более высокие показатели митотической активности, чем  растения из антропогенно-трасформированных популяций.  Средний митотический индекс - соотношение количества делящихся клеток и всех клеток зоны деления. Величина среднего МИ может значительно варьировать в разных корнях одного вида. Характерно, что в корнях, в которых МИ оказывается высоким для одной ткани, индекс других тканей может быть низким. Наблюдения за изменением митотической активности и длительностью каждой фазы митоза дают представление только о качественной стороне изменения продолжительности цикла и синхронности деления. Более высокий МИ при неизменном соотношении фаз деления свидетельствует о том, что клетки ускоренно проходят митотический цикл. Более низкий МИ и одновременное увеличение количества клеток в некоторых фазах свидетельствует о том, что клетки медленнее проходят эти фазы митоза [18]. 

Снижение доли профаз и метафаз происходит только в самом конце зоны митозов, а ближе к кончику корня МИ, как правило, увеличивается без изменения соотношения фаз. Это  показывает, что при уменьшении МИ здесь не меняется продолжительность фаз митоза. Уменьшение же МИ в базальном конце меристемы  бесспорно связано с окончанием митозов и переходом к интенсивному растяжению. Для Allium cepa L. доказаны суточные ритмы митотической активности [19]. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.6. Разработка шкалы чувствительности критериев цитогенетического мониторинга 

 

Исследования нарушений митоза и мейоза позволяют выявлять ранние изменения цитогенетической системы организма и прогнозировать ее состояние в меняющихся условиях.  Применение ряда критериев цитогенетического мониторинга на одном тест-объекте расширяет пределы его чувствительности и позволяет уменьшить количество тест-систем и объектов для адекватной оценки влияния поллютантов ( Калаев В.Н., 2000 ). Необходимо выявить чувствительность различных цитогенетических показателей для создания шкалы критериев, по изменению которых можно оценивать силу воздействия загрязнителей на биообъекты.   

Широкое распространение для оценки степени генетического риска для человека получили методы цитогенетического мониторинга (ЦМ), позволяющие определить суммарную нагрузку, являющуюся интегральным показателем эффекта сложнейших комбинаций мутагенов и их модификаторов. На тест-объектах, как правило, применяется один из критериев, используемых в ЦМ: митотическая активность (МА), частота и спектр патологий митоза (ПМ), ядрышковая активность (ЯА), частота сестринских хроматидных обменов, количество хромосомных аберраций, микроядерный тест (МТ). Каждый из критериев имеет свои преимущества и недостатки, различную чувствительность к стрессовым воздействиям. Поэтому применение их по-отдельности не всегда позволяет точно оценить эффект загрязнителей. Применение батарей тестов значительно усложняет определение интегральной оценки загрязнения. Для решения проблемы предлагается использовать не один, а несколько критериев на одном тест-объекте [20].

Анализ результатов эксперимента, проведенного учеными Воронежского государственного университета на модельном объекте Zebrina pendula Schirt (облучались радоном ее отростки), и анализ литературных данных позволил им сделать вывод о том, что наиболее чувствительным цитогенетическим критерием  является ЯА. Далее в порядке убывания чувствительности: появление остаточного ядрышка на стадии метафазы-телофазы митоза, стимуляция МА, изменение спектра ПМ, увеличение их числа, микроядерный тест, депрессия МА. 

 
Рисунок 1 -   Шкала чувствительности критериев цитогенетического мониторинга [20].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

Цитогенетические показатели как и любые другие у живых организмов, характеризуются изменчивостью, обусловленной генотипическими особенностями организмов и колебаниями условий среды, например, погодных условий. Если показатели температуры и влажность не выходят за пределы нормы, типичной для данного региона, вызываемые ими изменения не снижают жизнеспособности организмов, т.к. они обеспечивают возможность для осуществления репаративных процессов. Пределы изменчивости цитогенетических показателей в таком случае также можно рассматривать как нормальное. Знание их важно для сравнения с таковыми в условиях антропогенного загрязнения, что позволяет оценить степень загрязнения среды и генетического риска для человека.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы:

 

1. Ваулина Э.Н. и др., 1977; Турков В.Д. и др.,1990; Глотов Н.В.и др., 1995. 

 

2. Шумный В.К. и др., 1993.

 

3. Бурдин К.С., 1985; Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991.

 

4. Шарма А., 1989; Sharma A., 1985. 

 

5. Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991; Holub Z. et al.,  1986. 

 

6. Лучник Н.В., 1968; Шевченко В.В., 1969; Турков В.Д. и др., 1990.

 

7. Ивенс Х., 1966; Соколов Н.Н., Сидоров Б.Н.,1969. 

8. Мекшенков М.И.,1962;Бостон К.,Самнер Э., 1981.

 

9. Белецкий Ю.Д.и др.,1966;Корытова А.И., Михайлов О.Ф., Яцук Н.А., 1985.

 

10. Алов И.А., 1972; Дубинин Н.П. и др., 1980; Яблоков А.В. А.В.Остроумов С.А., 1985.

 

11. Мекшенков М.И., 1962. 

 

12. Вольф В.Г., 1958 . 

 

13. Захаров И.А.,1970. 

 

14. Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В., 1990

 

15. Бондарь  Л.М., Частоколенко Л.В. и др., 1991. 

 

16. Цитленок и соавт., 2002

 

17. Делоне Н.Л., 1960 .

 

18. Балодис В.А., 1968

 

19. Гриф В.Г., Иванов В.Б., 1975. 

 

20. Калаев В.Н., 2000.