Микробиология. Возможности генной инженерии

Микробиология. Возможности  генной инженерии 

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х  годов, она добилась сегодня больших  успехов. Методы генной инженерии преобразуют  клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих  в "фабрики" для масштабного  производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать  структуру и функции белков и  использовать их в качестве лекарственных  средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы. Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. Компания "Genentec" в 1980 году разработала технологию производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

 На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

 Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

 Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.

 Сейчас даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.

В медицинской микробиологии  все шире используются методы генной инженерии, с помощью которых  «заставляют» микроорганизмы продуцировать  нужные медицинской практике препараты

(вакцины, гормоны, интерфероны,  цитокины и др.), путем внесения в их геном соответствующего гена, т.е. получения рекомбинантного штамма с нужными свойствами путем «направленной» рекомбинационной изменчивости. Разберем принципиальный алгоритм такого методы на примере получения рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В.

А. Из генома вируса гепатита В вырезают ген, детерминирующего синтез HBs-Ag – белка, индуцирующего иммунный ответ против вируса. Затем внедряют его с помощью одного из видов рекомбинационной изменчивости в геном дрожжевой клетки (как вариант может использоваться кишечная палочка).

Б. Затем добиваются манифестации гена – его дерепрессии, так как  экзогенный генетический материал, интегрированный  в хромосому, как правило, репрессируется. С дерепрессированного гена снимается информация, и рекомбинантная клетка начинает продуцировать соответствующий белок.

В. Клональная культура, содержащая рекомбинантные клетки, выращивается в хемостате, где клетки синтезирует большое количество HBs-Ag.

Г. Затем отделяют культуральную среду от микробных клеток и проводят очистку HBs-Ag.

Д. В результате получается вакцина, содержащая HBs-Ag, но не содержащая ни самих вирусных частиц, ни их фрагментов