Молекулярно-генетическая лаборатория

 

 

 

 

       Реферат на  тему:

 

«Молекулярно-генетическая                                            лаборатория»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                             

                                                                                                                                   Выполнил

                                                                      Ивашев Антон

 

Организация работы молекулярно-генетической лаборатории в крупных клинических  и диагностических центрах

 

Сегодня молекулярно-генетические методы используются для диагностики раз­личных заболеваний и выявления их причин. Уже стало рутинным тестирова­ние крови для выявления ДНК/РНК различных вирусов, исследование генома пациента для поиска маркеров наследственных и онкологических заболеваний, а также аллельных вариантов различных генов. Как правило, большинство та­ких исследований выполняются в разных лабораториях клиники, а зачастую даже в различных диагностических центрах. Для сбора необходимого материа­ла пациенты подвергаются многократной процедуре взятия крови из вены, биопсиям или пункциям. Получение и обработка результатов также представ­ляют собой длительный процесс.

Задача молекулярно-генетических исследований в том, чтобы в крови  или другом биологическом материале  пациента выявить и охарактеризовать после­довательности ДНК - чужеродные (вирусные, бактериальные или грибковые) или собственную ДНК пациента. Метод, позволяющий выполнять все эти ис­следования, - полимеразная цепная реакция. Для ее проведения требуется не­сколько десятков нанограммов ДНК/РНК. Обычно для исследований берется от одного до десяти миллилитров крови, при этом выделяются десятки тысяч нанограммов ДНК. Следовательно, количества любой ДНК - геномной, вирусной или бактериальной, выделенной из этого объема крови, хватит на десятки или даже сотни молекулярно-генетических определений. Таким образом, большин­ство исследований можно проводить на материале, полученном в результате одного взятия крови, пункции или биопсии. Если архивировать образцы ДНК больных, то с ними можно проводить исследования, необходимость в которых возникла в процессе лечения, не делая новых заборов крови. Таким образом, минимизируется травмирование пациента, количество реактивов для выделе­ния генетического материала и соответствующие трудозатраты, а значит, стоимость анализа, время исследования и вместе с тем возрастает его информатив­ность.

Кроме того, наличие архивных материалов позволяет сравнивать препара­ты в динамике заболевания и оценивать эффективность лечения. По-видимому, такой архив или банк должен стать обязательной частью современной молекулярно-генетической лаборатории крупного центра или клиники.

Для клинических центров наличие  банка генетического материала  больных может иметь большое  значение, поскольку по мере обследования и лечения па­циентов может возникнуть необходимость выполнения последующих молекулярно-генетических исследований, которые можно провести на матери­але, хранящемся в банке. Кроме того, компоненты крови, взятые в начале ис­следования и замороженные (например, в случае выявления вируса), позволяют оценить эффективность применения противовирусных препаратов по измене­нию концентрации вируса. То же можно сказать и об эффективности лечения онкологических заболеваний и гемобластозов, которую можно контролировать, отслеживая поведение опухолевых клонов.

Как уже было сказано выше, разные молекулярно-генетические исследова­ния часто бывают разнесены по различным лабораториям. Наличие вирусов в крови выявляют в бактериологической лаборатории, аллельные варианты анти­генов (HLA, HPA) - в иммунологической, полиморфизмы - в соответствующих профильных лабораториях, изучающих заболевание, вызванное данным поли­морфизмом, и т. д. Материалом для всех этих исследований может служить кровь одного и того же больного, причем каждая из этих лабораторий будет вы­делять из нее ДНК или РНК. Основной применяемый метод во всех случаях -полимеразная цепная реакция, т. е. приборная база для выполнения исследова­ний требуется одна и та же. Разница только в наборах реактивов, выявляющих определенную последовательность ДНК. Поэтому, на наш взгляд, нецелесо­образно дублировать приборы, реактивы, трудовые ресурсы и тратить время для параллельной работы в различных подразделениях. Правильнее было бы сосредоточить хорошо оснащенную приборную базу для молекулярно-генетических исследований в рамках одной соответствующей лаборатории, которая смогла бы легко расширять арсенал своих исследований.

В настоящий момент в ГНЦ РАМН разрабатывается такой комплексный  подход к молекулярно-генетическим исследованиям пациентов, находящихся  на лечении в клинике Центра.

Алгоритм проведения молекулярно-генетических исследований в нашей лаборатории  следующий:

1. Кровь пациентов поступает  обычно в вакуумных пробирках  (вакутейнерах) объемом 4-10 мл. Для предотвращения свертывания при взятии крови ис­пользуются вакутейнеры, содержащие ЭДТА. Биоптаты и пунктаты поступают также в пробирках, содержащих раствор ЭДТА.

2. Пробирки с кровью подвергают  мягкому центрифугированию для раз­деления крови на две фазы - плазму и клетки.

3. Плазму отделяют и помещают  в специальные контейнеры для  дальней­шего хранения и замораживают.

4. По мере необходимости плазму  размораживают (наш опыт показывает, что замороженная плазма выдерживает  до 10 размораживаний-замораживаний без изменения количества определяемых в ней вирусов). Из аликвоты плазмы выделяют пул ДНК/РНК для выявления чужеродных геномов, присутствующих в крови пациента (вирусов, бактерий, грибов), который тоже хранят в заморо­женном виде для дальнейших исследований.

5. После отбора плазмы из оставшегося  материала выделяют клетки, осаж­дают их и замораживают осадок клеток для последующих исследований.

6. Аликвоты осадка клеток используют для выделения ДНК или РНК. Неис­пользованный остаток выделенной ДНК/РНК замораживают и хранят для дальнейших исследований.

Таким образом, кровь больного, поступившая  в лабораторию, обрабатыва­ется и хранится в банке в виде трех образцов - плазмы, клеток и выделенных ДНК/РНК. Сегодня каждый образец архивной крови можно проанализировать одновременно на наличие шести вирусов: HIV-1, HBV, HCV, EBV, СМУи PV B19, определить их концентрацию в крови, выявить генотипы вирусов HBV и HCV, провести генетическое типирование факторов предрасположенности к раз­личным заболеваниям (тромбофилии, гемохроматозу, болезням Вильсона - Ко­новалова и Гоше, инфекционным заболеваниям и т. д.), изучить клональные перестройки при лимфопролиферативных заболеваниях, выявить и дать коли­чественную характеристику соматическим мутациям при миелопролиферативных заболеваниях, причем все эти исследования можно сделать в течение одно­го рабочего дня.

Таким образом, наш опыт показывает, что для эффективной работы молекулярно-генетической лаборатории необходимо создание архива или бан­ка генетического материала пациентов, проходящих лечение в клинике. Нали­чие в крупных клиниках молекулярно-генетической лаборатории, имеющей в своем составе банк ДНК больных и подразделение, осуществляющее широкий спектр анализов материала, хранящегося в банке, позволит проводить основ­ную массу молекулярно-генетических исследований на выделенном один раз препарате ДНК/РНК в течение всего времени пребывания пациента в клинике. Следовательно, как уже говорилось, отпадает необходимость лишний раз под­вергать больных не слишком приятным процедурам, высвобождаются время, материалы и реактивы, необходимые для забора, обработки крови и выделения ДНК. Кроме того, такой банк может иметь громадное значение для медицин­ских центров в случае проведения ими новых научных изысканий - не надо тра­тить годы на подбор больных, подходящих для исследований, и наблюдение за ними в динамике, поскольку можно работать с уже имеющимся в архиве банка материалом и сопоставлять результаты с историей болезни пациента.

 

Литература:

1. http://www.zdrav.ru/articles/practice/detail.php?ID=79270
2. Журнал "Справочник заведующего клинико-диагностической лабораторией"