Молекулярные основы транскрипции трансляции

Эффективность инициации  на разных промоторах, их "сила", существенно различается: если с некоторых промоторов инициируется всего одна-две молекулы РНК за период деления клетки, то с других (например, с промоторов генов рибосомных РНК ) инициация происходит раз в одну-две секунды. Частота, с которой инициируется транскрипция при насыщающей концентрации субстратов, зависит главным образом от равновесной константы образования закрытых промоторных комплексов и константы скорости превращения закрытого комплекса в открытый. Для самых сильных промоторов обычно характерны высокие значения обеих констант (высокое сродство РНК полимеразы к промотору и быстрый переход промоторного комплекса в активное открытое состояние). Для слабых промоторов характерны низкие значения этих величин. Слабость промоторов с низким сродством к РНК-полимеразе особенно заметна при низких концентрациях РНК-полимеразы и может быть скомпенсирована при ее высоких концентрациях. Промотор с низким сродством к РНК-полимеразе может быть достаточно сильным, если ему присуща высокая скорость перехода в открытое состояние. Сила большинства промоторов увеличивается с увеличением степени отрицательной сверхспирализации ДНК. Это объясняется тем, что отрицательная сверхспирализация облегчает расплетание ДНК и тем самым переход в открытый промоторный комплекс. Существуют, однако, промоторы, сила которых не зависит или даже уменьшается с увеличением степени сверхспирализации. Этому эффекту объяснения пока не найдено.

Инициация транскрипции начинается со сборки на промоторе прединициационного комплекса, в состав которого входят молекулы РНК-полимеразы и матричной ДНК. Если в случае РНК-полимеразы E. coli и других прокариот для осуществления этого процесса нет необходимости в присутствии других белковых факторов, то механизм сборки инициационного комплекса с участием РНК-полимеразы II носит более сложный характер.

Существуют две модели инициации транскрипции РНК- полимеразой II. В соответствии с одной из них на промоторе происходит постепенная (ступенчатая) сборка инициационного комплекса из отдельных компонентов. Другая модель акцентирует внимание на то, что Pol II может входить в состав инициационного комплекса в виде холофермента, состоящего из многих субъединиц. Сборка такого комплекса начинается с последовательного связывания с промотором основных факторов транскрипции.

1.5. Элонгация транскрипции: общие сведения

Момент перехода РНК-полимеразы от инициации транскрипции к элонгации точно не определен. Три основных биохимических события характеризуют этот переход в случае РНК-полимеразы E.coli : отделение сигма-фактора, первая транслокация молекулы фермента вдоль матрицы и сильная стабилизация транскрипционного комплекса, который кроме РНК- полимеразы включает растущую цепь РНК и транскрибируемую ДНК. Эти же явления характерны и для РНК-полимераз эукариот. Переход от инициации к элонгации сопровождается разрывом связей между ферментом, промотором, факторами инициации транскрипции, а в ряде случаев - переходом РНК-полимеразы в состояние компетентности в отношении элонгации (например, фосфорилирование CTD-домена у РНК-полимеразы II ). Фаза элонгации заканчивается после освобождения растущего транскрипта и диссоциации фермента от матрицы ( терминация ).

На стадии элонгации в  ДНК расплетено примерно 18 н.п. Примерно 12 нуклеотидов матричной нити ДНК  образует гибридную спираль с  растущим концом цепи РНК. По мере движения РНК-полимеразы по матрице впереди нее происходит расплетание, а позади - восстановление двойной спирали ДНК. Одновременно освобождается очередное звено растущей цепи РНК из комплекса с матрицей и РНК-полимеразой. Эти перемещения должны сопровождаться относительным вращением РНК-полимеразы и ДНК. Трудно себе представить, как это может происходить в клетке, особенно при транскрипции хроматина. Поэтому не исключено, что для предотвращения такого вращения двигающуюся по ДНК РНК-полимеразу сопровождают топоизомеразы.

Элонгация осуществляется с  помощью основных элонгирующих факторов, необходимых, чтобы процесс не останавливался преждевременно [ Nikolov ea 1997 ]. В последнее время появились данные, показывающие, что регуляторные факторы также могут регулировать элонгацию. РНК-полимераза в процессе элонгации делает паузы на определенных позициях гена. Особенно четко это видно при низких концентрациях субстратов. В некоторых участках матрицы длительные задержки в продвижении РНК-полимеразы, т.н. паузы, наблюдаются даже при оптимальных концентрациях субстратов. Продолжительность этих пауз может контролироваться факторами элонгации.

1.6. Терминация транскрипции у эукариот: общие сведения

У эукариот обнаружены три  фактора терминации транскрипции, необходимых для освобождения РНК-полимераз из транскрипционных комплексов на терминаторах - по одному для РНК-полимераз I, II и III.

Белок N-TEF дрозофилы индуцирует освобождение транскриптов, синтезированных РНК-полимеразой II, и при его функционировании происходит расщепление ATP.

У дрожжей белковый фактор Reb-1 связывается с природными терминаторами транскрипции на ДНК, обеспечивая как остановку элонгирующей РНК-полимеразы I на этих терминаторах, так и последующее освобождение РНК из транскрипционных комплексов. Удаление в результате делеции из рибосомной транскрипционной единицы Reb-1-связывающего сайта нарушает правильное образование 3'-концов рРНК in vivo.

Мышиный фактор TTF-1, который также является ДНК- связывающим белком, необходим для правильной терминации транскрипции РНК-полимеразой I в клетках этих животных. У них же обнаружен LА-белок, специфически взаимодействующий с РНК, функционирование которого требуется для образования транскриптов полной длины под действием РНК-полимеразы III, что происходит в результате освобождения РНК из транскрипционных комплексов и реинициации транскрипции.

Терминация транскрипции у эукариот - это пока довольно плохо изученный процесс. Ясно, однако, что он происходит за пределами собственно гена в области спейсера ( Falck-Pederson ea, 1985 ). Эксперименты с разными искусственными конструкциями показывают, что для терминации транскрипции нужно существование в геноме зоны терминации и обязательно расположенного перед нею сайта полиаденилирования. Если последний убрать, то транскрипция идет за зону терминации. В то же время зону терминации можно удалять и приближать к сайту полиаденилирования, и терминация все равно будет происходить в ее пределах.

Нуклеотидные последовательности зон терминации, прилежащих к разным генам, содержат ряд гомологичных областей, однако в настоящий момент вопрос о природе сигналов терминации остается открытым. Для этого необходимы опыты по мутагенезу в зонах терминации.

Транскрипции регуляция: промоторная

Изменение характера экспрессии генов можно наблюдать в бесклеточных системах, компонентами которых являются собственно ген, энхансер и специфические регуляторные белки. Оказывается, что энхансер в зависимости от добавляемого белкового фактора может начать вести себя и как негативно действующий "глушитель" (англ. silencer) экспрессии гена. Негативное действие такого элемента, проявляется при связывании с тканеспецифичным трансдействующим белковым фактором. Негативное действие сайленсеров, как и в случае энхансеров, не зависит от положения и ориентации относительно сайта инициации транскрипции.

По мере исследования регуляторных элементов генома эукариот оказалось, что не удается провести строгих  функциональных различий между энхансерами и элементами промотора. Прежде всего ориентация таких активных элементов промотора как GC-мотивы, может быть любой относительно направления транскрипции гена. Более того, промоторные элементы генов металлотионеина и генов теплового шока, отделенные от TATA-последовательности, определяющей сайт инициации транскрипции, также сохраняют специфические регуляторные свойства вне зависимости от ориентации.

Промоторный участок гена металлотионеина, включающий ряд регуляторных мотивов, способен сильно стимулировать экспрессию гена бета-глобина и в том случае, если промотор расположить на 3'-фланге относительно направления транскрипции, причем на значительном расстоянии от бета-глобина.

Примечательно, что экспрессия бета-глобина теперь будет зависеть от ионов металлов. В результате регуляторный участок гена металлотионеина можно рассматривать не только как промотор, но и как индуцируемый энхансер активности гена.

Подобным образом специфический  промотор генов теплового шока, отделенный от мотивов TATA и CCAAT и находящийся  на значительном расстоянии от старта транскрипции, вне зависимости от ориентации по отношению к нему активирует ген бета-глобина при повышении температуры.

Таким образом, регуляторные элементы генов, которые первоначально  относили либо к промоторным, либо к энхансерам, обладают рядом общих функциональных характеристик.

На физической карте регуляторной области гена они могут располагаться  в одном районе, создавая сложную  мозаику регуляторных сигналов.

Примеры с генами металлотионеина или белков теплового шока показали, что цис-действующие регуляторные элементы способны активно выполнять свою роль при рекомбинации с гетерологичными или с гомологичными генами организмов, отстоящих в эволюционном плане достаточно далеко друг от друга.

Следовательно, взаимодействие этих элементов и соответствующих  белковых транс-действующих регуляторов генной активности основано на достаточно общих консервативных принципах, сохраняющихся в процессе эволюции.

Возможность длительной эволюционной сохранности цис- и трансдействующих компонентов, отвечающих за строгую тканевую и временную экспрессию генов, а следовательно, за регуляцию развития организма, неоднократно была показана экспериментально.

Глава 2. АНАЛИЗ ТРАНСЛЯЦИИ КАК  ПРОЦЕССА СИНТЕЗА БЕЛКОВ В ЦИТОПЛАЗМЕ КЛЕТКИ

2.1. Трансляция: общие сведения

Трансляция - процесс синтеза  белка в цитоплазме клетки. Молекулярные процессы, лежащие в основе синтеза  белка, крайне сложны ( Kornberg R.D. et al, 1981 ; McGhee J.D. et al, 1980).

В синтезе белка участвует  три таких класса молекул РНК  ( мРНК, тРНК и рРНК ). Началом синтеза белка принято считать процесс транскрипции ДНК, в результате которого в ядре должна образоваться соответствующая информационная, или матричная, РНК (мРНК), которая затем должна перейти в цитоплазму клетки.

Процесс трансляции начинается с присоединения малой рибосомной субчастицы к молекуле мРНК. Особая инициаторная тРНК связывает малую рибосомную субчастицу со специальным старт- кодоном на мРНК. Присоединение большой субчастицы завершает сборку рибосомы.

Далее следует фаза элонгации. Каждая очередная аминокислота (находящаяся в комплексе с tРНК) присоединяется к карбоксильному концу растущего полипептида с помощью циклического процесса, состоящего из трех последовательных этапов: связывания аминоацил-тРНК, образования пептидной связи и транслокации рибосомы. Рибосома перемещается вдоль молекулы мРНК в направлении 5'-> 3' от одного кодона к другому до тех пор, пока не будет достигнут какой-либо из трех стоп-кодонов. К этому стоп-кодону присоединяется затем фактор освобождения, останавливающий трансляцию и вызывающий отделение завершенного полипептида от рибосомы. Энергия для биосинтеза белка обеспечивается гидролизом GTP.

Большинство данных о механизмах биосинтеза белка у эукариот было получено с использованием бесклеточных белоксинтезирующих систем. Важные результаты о механизмах трансляции у эукариот были получены с использованием стабильно трансформированных клеток животных и растений, выращиваемых в культуре. Установлено, что у растений и животных в основном функционируют одни и те же механизмы трансляции.

Клетки животных, кроме  основной системы трансляции, локализованной в цитоплазме, имеют дополнительную систему трансляции митохондрий, которая  по ряду свойств приближается к бактериальной. Клетки растений обладают дополнительной системой биосинтеза белка, функционирующей в хлоропластах.

2.2. Генетический код: общие сведения

Нуклеотидная последовательность гена определяет последовательность аминокислот  в белке.

Это соответствие обеспечивает генетический код. Три соседних нуклеотида в молекуле ДНК составляют триплет, а последовательность нуклеотидов  в триплете - код определенной аминокислоты, или кодон. Кодоны есть для каждой из 20 аминокислот, входящих в состав белка; в митохондриях генетический код несколько другой. Правила соответствия кодонов определенным аминокислотам или функциям называется генетическим кодом. За небольшими исключениями генетический код универсален для всех живых организмов. (Льюин, 1987 ). Так как четыре нуклеотида объединенные по три дают 64 варианта, а аминокислот всего 20, то большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном или другими словами: генетический код является вырожденным.

Универсальный генетический код. Трансляция начинается со стартового кодона, чаще всего это AUG, реже GUG, и  заканчивается на одном из терминирующих  или стоп-кодонов: UAA,UAG,UGA. Все кодоны, за исключением стоп кодонов, называются смысловыми. Стоп кодоны еще называют нонсенс кодонами. Группу кодонов  кодирующих одну и ту же аминокислоту называют серией. Вырожденность серий  варьирует от 1 (Trp, Met) до 6 (Ser, Arg, Leu). Многими авторами выделяется целый ряд свойств и особенностей генетического кода, но в данной базе данных они не рассматриваются.

Некоторые отклонения от универсального генетического кода у митохондрий  приведены в таблице (Минченко,Дударева,1990):

Генетический код имеет  следующие особенности:

1. Код - триплетный, т.е. одна аминокислота задается последовательностью из трех нуклеотидов, называемой кодоном.

2. Код не перекрывается, т.е. в последовательности оснований первые три основания кодируют одну аминокислоту, следующие три - другую и т.д.

3. Из таблицы генетического кода видно, что код - вырожденный : 20 аминокислот представлены 61 кодоном. Почти каждой аминокислоте соответствует несколько кодонов-синонимов.

4. Особенностью кода является  тенденция к группировке кодонов,  соответствующих одной аминокислоте. Часто основание в третьем  положении кодона оказывается  несущественным для его специфичности.  Одна аминокислота может быть  представлена четырьмя кодонами, различающимися только по третьему  основанию. Иногда различие состоит  в предпочтениии пурина пиримидину в этом положении. Меньшую специфичность этого положения в кодоне называют вырожденностью третьего основания.

5. Генетический код - универсален, т.е. все живые организмы (эукариоты, прокариоты и вирусы) используют один и тот же код.