Современные тест системы для иммуноферментного анализа

АО «Медицинский университет Астана»

       Кафедра микробиологии, вирусологии им. Ш.И.Сарбасовой

 

 

 

 

Самостоятельная работа студента

на тему:

 

 

Современные тест системы для иммуноферментного анализа

 

 

 

 

 

Выполнила: студенты 3 курса факультета

Медико-профилактического дела

_______________________________________

Проверила: ____________________________

Срок сдачи:

Оценка:

 

 

 

                                     

 

 

Астана 2014

План:

1. Введение
2. Иммуноферментный анализ
3. Современные тест – системы для иммуноферментного анализа
4. Заключение
5. Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Иммуноферментный анализ представляет собой вид лабораторного исследования, в основу которого положена иммунологическая реакция по типу «антиген-антитело». На сегодняшний день известно несколько десятков модификаций данного метода исследования. Своё название иммуноферментный анализ получил благодаря использованию ферментативной метки, которая вводится в один из компонентов иммунологической реакции.

При взаимодействии специфического антитела с антигеном происходит активация фермента, и именно количество образованных продуктов цветной (ферментативной) реакции, определяемое по интенсивности их окрашивания, позволяет оценить количество антигенов или антител во взятом для исследования материале. Таким образом, иммуноферментный анализ позволяет провести качественную и количественную диагностику определённой инфекции.

В последнее время популярность иммуноферментного анализа существенно выросла, что объясняется высокой специфичностью и разнообразием используемых тест-систем. Для данного вида исследования в качестве материала используется плазма или сыворотка венозной крови, забор которой производится натощак.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Иммуноферментный анализ

Иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Из-за разнообразия объектов исследования — от низкомолекулярных соединений до вирусов и бактерий, и многообразия условий проведения ИФА существует большое количество вариантов этого метода.

Возможна классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод является неконкурентным. Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным.

Примером неконкурентного формата ИФА является «сэндвич»-метод. К носителю с иммобилизованными антителами добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от несвязавшихся компонентов и добавляют меченные ферментом специфические антитела. После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. Ферментативная реакция (цветная реакция) проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе проведения исследования. Интенсивность окрашивания зависит от количества выявленных специфических антител. Результат оценивается спектрофотометрически или визуально.

«Сэндвич»-метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, по крайней мере, две антигенные детерминанты. На этом формате основано большое количество тест-систем для иммуноферментной диагностики различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции.

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченыйантиген конкурируют за связь с иммобилизованным антителом.

К иммобилизованным антителам добавляют раствор, содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов. Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.

Непрямая схема с использованием меченых антивидовых антител является одной из наиболее распространенных схем ИФА. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют и после удаления несвязавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов, причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализируемый образец и меченый реагент вводятся в систему на разных стадиях, что устраняет влияние различных эффекторов, содержащихся в образце, на каталитические свойства ферментной метки. Однако такая схема анализа усложняет его проведение из-за введения дополнительных стадий.

Как любые иммунохимические методы анализа, ИФА может давать ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Например, ложноположительные результаты при определении антител к различным инфекциям могут возникнут за счёт ревматоидного фактора, представляющего собой иммуноглобулин M против собственных иммуноглобулинов G человека; за счёт антител, образующихся при различных системных заболеваниях, нарушениях обмена или приёме лекарственных препаратов; у новорождённых такие ложноположительные реакции могут возникать за счёт образования в организме ребёнка M-антител к иммуноглобулину G матери. Помимо этого, причиной ложнопололожительных результатов может быть синдром поликлональной активации. При этом, особые вещества — суперантигены — неспецифически стимулируют выработку B-лимфоцитами антител к различным инфекциям. Практически это выражается в неспецифическом нарастании титра антител сразу ко многим возбудителям. Ложноотрицательные результаты при определении антител могут быть обусловлены состояниями иммунодефицита, а также техническими ошибками при постановке реакции.

Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Современные тест – системы для иммуноферментного анализа

Посредством специальных тест-систем иммуноферментного анализа можно выявлять как антитела, относящиеся к различным классам иммуноглобулинов, так и проводить количественный анализ иммуноглобулинов определённого класса.

Используя тест-системы, позволяющие выявлять иммуноглобулины, относящиеся к различным классам, можно с высокой вероятностью судить о стадии инфекционного процесса, поскольку иммуноглобулины вырабатываются организмом человека в строго предопределённой последовательности.

Иммуноглобулины, относящиеся к классу М, вырабатываются иммунной системой человека раньше всех при инфицировании, но их уровень быстро снижается при элиминации возбудителя. Совершенно иначе ведут себя иммуноглобулины, принадлежащие к классу G. Они вырабатываются значительно позже при инфицировании, но циркулируют в организме человека и после выздоровления.

Особое внимание уделяется в ходе иммуноферментного анализа иммуноглобулину класса А, а также его соотношению с иммуноглобулинами, принадлежащими к классам М и G. Предположить повторное заражение можно при высоких концентрациях иммуноглобулинов А и М, а о переходе острого процесса в хронический свидетельствуют повышенные титры иммуноглобулинов G и А. Таким образом, выявление иммуноглобулинов определённого класса позволяет оценить динамику инфекционного процесса.

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяют на:

Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Общее направление развития ИФА-диагностикумов — это направление от лизатных тест-систем, которые принято называть тест-системами первого поколения, к рекомбинантным и пептидным.

 

Технология получения рекомбинантных белков позволяет получить в достаточно чистом виде аналог практически любого отдельного антигена.

Для создания высококачественной рекомбинантной тест-системы необходимо из всего антигенного многообразия возбудителя выбрать антигены, которые были бы иммуногенными (то есть, в организме инфицированного человека должны вырабатываться антитела к этим антигенам) и высоко специфичными (то есть, характерными лишь для данного возбудителя и, по возможности, не дающими перекрёстных реакций с антителами к другим антигенам).

Кроме того, большое значение имеет качество очистки рекомбинантных белков. В идеальном случае возможно получение рекомбинантной тест-системы практически со 100% специфичностью при высокой чувствительности.

На практике этого не всегда удаётся достичь, однако специфичность лучших рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

Чаще всего иммуноферментный анализ применяется для выявления в крови антител, которые вырабатываются иммунной системой человека в ответ на попадание в организм антигенов возбудителей различных заболеваний. Однако при помощи данного метода исследования можно выявлять и антигены возбудителей всевозможных инфекции в данной биологической жидкости.

В современной медицине метод иммуноферментного анализа используется для диагностики различных заболеваний вирусной и бактериальной природы, для выявления аутоантител, определения уровня гормонов и для нахождения маркеров онкопатологии.

На сегодняшний день специфичность и чувствительность данного лабораторного метода оценивается как минимум в 90%. Специфичность некоторых современных тест-систем иммуноферментного анализа, в частности тест-систем рекомбинантного типа, стабильно приближается к 100%.

Работа с ИФА-тест-системами не требует высокой профессиональной подготовки специалистов, так как диагностические наборы, предлагаемые производителями, укомплектованы всеми материалами и реагентами, необходимыми для постановки реакции. Особо следует отметить методическую доступность ИФА при использовании тест-систем ЗАО «Вектор Бест». Кроме того, все ИФА-тест-системы предусматривают автоматический учет результатов, что исключает субъективность в их оценке. Тест-системы ИФА можно рассматривать как скрининговые, обладающие, в то же время, высокими диагностическими качествами.

Следует отметить, что выявление методом иммуноферментного анализа антигена возбудителя того или иного заболевания, в отличие от вирусологических и бактериологических методов исследования, не зависит от его жизнеспособности. То есть антигены будут найдены при помощи тест-систем ИФА и в том случае, если возбудитель продолжает свою жизнедеятельность, и тогда, когда в результате лечения или за счёт внутренних резервов организма возбудитель был обезврежен.