Состояние антиоксидантной системы инфицированных грибом Heterobasidion annosum (Fr.) Bref проростков Pinus sylvestris L.

 

ВВЕДЕНИЕ

Растения противостоят инфекциям  и другим стрессовым воздействиям окружающей среды посредством развития комплекса                                        молекулярно-биохимических реакций. Восприятие, передача информации о действии факторов окружающей среды на растения и, соответственно,           индукции ответных реакций, осуществляется с участием сигнальных систем. Наиболее ранней ответной реакцией растительного организма на                    внедрение патогена    является локальная генерация активных форм кислорода (АФК) - окислительный взрыв, запускающий цепь последующих защитных   реакций [15].

Для снижения уровня АФК  в растительных тканях включаются            механизмы детоксикации, связанные с активацией ферментов антиоксидантной системы. Возможно, что развитие или подавление следующих реакций в      растительном организме, в первую очередь, зависит от концентрации Н₂О₂ в зоне контакта двух противоборствующих организмов.

Пероксид водорода (Н₂О₂) - наиболее стабильная молекула активных форм кислорода и в метаболизме растения играет значительную роль, причем его накопление как ответ на любой фактор окружающей среды может привести к повреждению соответствующих участков растения-хозяина. Пероксид        водорода участвует как в нормальных метаболических процессах растений,    активизируя разные сигнальные пути, которые регулируют рост и развитие   растений, так и в защите растений против патогена [28].

Heterobasidion annosum(Fr.) Bref. - гриб, который наносит большие   убытки монокультурам Pinus sylvestris L. Патологические процессы            предопределены проникновением H. annosum в ткани P. sylvestris проявляются    в усилении свободнорадикальных процессов и активировании                          антиоксидантных систем. Следует заметить, что вопрос изменения                  содержимого пероксида водорода в инфицированных грибом H. annosum     проростках P. sylvestris изучено достаточно слабо.

Целью работы было определение изменения состояния антиоксидантной защиты инфицированных грибом Heterobasidion annosum проростков P.sylvestris.

Для достижения цели были поставлены такие задачи:

1.определить перекисное  окисление липидов в проростках  P.sylvestris;

2. определить содержание  пероксида водорода в проростках P.sylvestris.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие представления об активных формах кислорода

        Появление на Земле первых фотосинтезирующих организмов, благодаря которым в атмосфере появился кислород,  предопределило доминирование на планете аэробных форм жизни. Оксигенный фотосинтез и аэробное дыхание – два фундаментальных процесса, обеспечивающих энергией клетки растений и животных, а также многих бактерий. Оба эти процесса связаны с окислительно- восстановительными превращениями молекулярного кислорода.  Участие    молкулярного кислорода,  который является очень сильным окислителем,  в        метаболизме возможно благодаря тому,  что молекула О₂ относительно         стабильна и спонтанно не реагирует с биомолекулами.  Однако все аэробные образованием в клетках активных форм кислорода  (АФК).  Под этим термином                  подразумевают формы кислорода с чрезвычайно высокой реакционной        способностью,  которые могут окислять практически все классы биологических молекул – белки, липиды мембран, молекулы ДНК и т.д. [31].

         К АФК относят синглетный кислород  (¹О₂),  супероксид анион радикал (О₂^•-),  гидропероксидный радикал (НО₂^•),  пероксид водорода (H₂О₂),         гидроксильный радикал (HО^•), в некоторых случаях озон  (О₃). АФК постоянно образуются в растительных и животных клетках в реакциях и процессах,           в которых участвует молекулярный кислород.  В нормально функционирующих клетках содержание АФК поддерживается на низком уровне, т.к. специальные ферментные системы постоянно заняты их ликвидацией. В норме концентрации АФК в клетках не высоки: концентрация О₂^•-  составляет порядка 10 ^-11 М, Н₂О₂ – 10^-8М, НО^•-меньше 10^-11М. Однако в стрессовых условиях содержание АФК в клетках начинает быстро увеличиваться и развивается окислительный стресс[32].

     Окислительный стресс в растениях возникает в результате действия      практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху,  почвенное засоление,  низкие и высокие температуры,  ультрафиолетовое      излучение,  недостаток элементов минерального питания,  патогены различной природы, загрязнение различными ксенобиотиками и т.д. [31].

 

1.2. Основные типы АФК, их образование и свойства

     Молекулярный кислород в обычном состоянии представляет собой триплет  (имеет два неспаренных электрона с параллельными спинами, которые          локализованы на различных орбиталях).  Большинство органических молекул синглетны,  их электроны обладают антипараллельными спинами.  Вследствие различий в направлении спинов электронов взаимодействие органических     молекул с молекулой кислорода протекает достаточно медленно.  Однако в клетке существует вероятность образования АФК, которые представляют собой как свободно радикальные частицы  (супероксидные,  пероксидные,              гидроксильные радикалы),  так и нейтральные молекулы  (пероксид водорода,  синглетный кислород).  Свободный радикал представляет собой частицу,   имеющую неспаренный электрон на внешней электронной орбитали. Важными свойствами свободного радикала является его высокая химическая активность и то, что он не может исчезнуть,  пока не прореагирует с другим свободным  радикалом в реакции, которую называют реакцией дисмутации [22].

     Формирование АФК происходит при неполном восстановлении                 молекулярного кислорода до воды одним, двумя и тремя электронами.

     В результате захвата молекулой одного электрона образуется                             супероксидный радикал (О₂^•-) или его протонированная форма                              гидропероксидный радикал (НО₂^•) при слабых значениях рН.

      Наиболее опасен, особенно для мембранных структур, именно                   супероксидный радикал.  В отличие от молекулярного кислорода,  для               передвижения          которого мембраны не представляют преграды,                 супероксидный анион,  обладая зарядом,  окружен молекулами воды,  что не дает ему возможности преодолеть гидрофобный мембранный барьер.  Кроме того,  он имеет большое время жизни и становится источником других АФК [31]. 

       Образование пероксида водорода (H₂О₂)  происходит в результате             присоединения одного электрона и двух протонов к супероксидному радикалу и также в результате взаимодействия (дисмутации) двух молекул супероксида:

2О₂^•- + 2Н⁺ → Н₂О₂ + О₂.

       Пероксид водорода относится к окислителям средней силы.  Благодаря           относительно продолжительному времени жизни и растворимости в                 липидномбислое,  пероксид может легко диффундировать через мембраны  (через аквапорины). При дальнейшем одноэлектронном восстановлении           возможно появление гидроксильного радикала (HО^•),  очень сильного               окислителя.  Этот радикал не способен к внутриклеточной миграции,  так как моментально вступает в реакцию с биологическими молекулами.                           Гидроксильный радикал не только инициирует разрушение мембран и                       деградацию белков, взаимодействуя с остатками многих аминокислот, но и     разрушает углеводные мостики между нуклеотидами, разрывая цепи ДНК и РНК. Полагают, что такие процессы могут быть факторами природного               мутагенеза. Гидроксидный радикал является наиболее опасным еще и потому, что в растительных клетках нет ферментных систем, способных к его                  нейтрализации [31].

     К АФК относится также синглетный  кислород. Основной путь его                     образования обусловлен световыми реакциями,  которые опосредованы                  пигментами-фотосенсибилизаторами  (главным образом хлорофиллом).                Поглощая квант света,  этот пигмент переходит в синглетное  или триплетное  возбужденное состояние.  Молекулы пигмента в обоих возбужденных                    состояниях, сталкиваясь с молекулярным кислородом, передают на него свою энергию,  в результате чего и образуется химически очень активный                       синглетный молекулярный кислород.    Основное значение в его генерации имеют триплетные состояния пигментов,  которые обладают более                          значительным временем жизни.  Кроме того,  возможен и другой механизм              фотодинамического действия –  образование свободных радикалов при                    диссоциации комплекса триплетной молекулы пигмента,  кислорода и          субстрата.  Синглетный кислород может быстро реагировать с большинством                      органических молекул (RH), продуцируя гидропероксиды:

RH +¹О₂   → ROOH.

     Эффективным генератором синглетного кислорода является важнейший пигмент фотосинтеза –  хлорофилл,  и в клетках растений всегда имеется                 опасность того, что этот пигмент проявит свое повреждающее действие [33].

 

1.3. Повреждение биомолекул активными формами кислорода

     Активные радикалы,  главным образом НО^•,  взаимодействуя с                              органическими веществами,  образуют гидропероксиды ДНК,  белков,  липидов (ROOH).  Изменения макромолекул под действием АФК называются                   окислительными модификациями макромолекул.

         Органические  гидропероксиды ROOH  по своей структуре подобны Н₂О₂ и характеризуются высокой реакционной способностью.  При последующих превращениях они переходят в спирты,  альдегиды,  эпоксиды и другие         окисленные  органические соединения. Образование ROOH называют            перекисным окислением.

 

1.3.1.Повреждения липидов

     АФК приводят к перекисному окислению липидов  (ПОЛ),  вызывая в   остатках полиненасыщенных жирных кислот  (ПНЖК)  цепные реакции с              образованием липидных радикалов , пероксидов, гидропероксидов и                       алкоксилов.

     Продукты расщепления,  несущие двойную связь,  под действием радикалов подвергаются дальнейшему перекисному окислению и распаду.  В результате жирные кислоты образуют целый ряд соединений. Многие из них представляют собой альдегиды,  которые обладают высокой биологической активностью и часто высокотоксичны.  При распаде жирных кислот,  сопровождающем ПОЛ, сначала образуют диеновые коньюгаты, а затем такие метаболиты, как                   малоновый диальдегид. [23].

    Продуктами ПОЛ могут быть и более простые соединения,  например такие, как пентан и этан. ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны,  что в свою очередь приводит к нарушениям функций мембранных белков и        нарушению внутриклеточной компартментации веществ.  Продукты            окислительной модификации липидов вызывают мутации и блокируют        клеточное деление. Прежде ПОЛ считали исключительно спонтанным         процессом, протекающим без участия ферментов. Затем было показано, что важную роль в ПОЛ играют и ферментативные реакции, в частности реакции, катализируемые липоксигеназами.  В норме липоксигеназы не активны.       Активация этого фермента наблюдается при стрессах, связанных с                  повреждением растений, при нападении насекомых или травоядных животных. 

     Окисление липидов с помощью этих ферментов приводит к образованию

специфических веществ –  эйкозаноидов,  выполняющих функцию сигнальных

молекул при экспрессии генов  [22]. 

    Таким образом,  в результате перекисного окисления липидов мембран               возникает целый каскад свободнорадикальных реакций с образованием             разнообразных спиртов,  эфиров,  альдегидов.  Среди этих соединений могут быть и токсичные.  Например, 4-гидрокси-2-ноненал, 4-гидрокси-2-гексанал,  малоновый диальдегид оказывают токсическое действие в клетках растений,  модифицируя структуру белков и ДНК.

 

1.3.2.Повреждения белков

     Белки,  так же как липиды и нуклеиновые кислоты, повреждаются АФК. При действии АФК происходит окисление аминокислот с образованием                         пероксильных радикалов.

     Из пероксильных радикалов образуются гидропероксиды и алкоксильные

радикалы.  Последние обладают высокой реакционной способностью и сами

могут индуцировать образование  высокореактивных соединений радикальной

природы.  Гидропероксиды также генерируют новые радикалы,  если имеются

ионы металлов с переменной валентностью. Производными пероксидных групп

(–С–О–ОН) являются группы  –СОН  (о- и м-тирозины), –С(ОН)₂, карбонилы и

другие соединения.  Образуются также димеры  (дитирозины)  и происходит

окислительное гликозирование белков.  АФК-индуцированные окислительные

модификации аминокислот  приводят к нарушению третичной структуры            белков,  к их денатурации и агрегации с сопутствующей потерей                        функциональной активности [34].

 

1.4. Сигнальная роль АФК

     Довольно долго АФК рассматривали как неизбежное зло, возникшее при переходе большинства организмов к аэробному образу жизни.  Однако              оказалось,  что роль этих опасных молекул двойственная. Клетки растений  воспринимают и используют АФК в качестве сигнальных молекул, вторичных мессенджеров,  которые помогают им анализировать внешние воздействия и внутренние сигналы.  Более того,  в некоторых случаях растительная клетка специально начинает продуцировать АФК,  чтобы с их помощью включать те или иные процессы.      Условия среды часто становятся для растений               стрессовыми,  тогда нарушается нормальный метаболизм,  подавляется рост,  изменяются процессы развития и,  в экстремальных случаях,  наступает гибель организма. 

     Однако растения могут выдержать и адаптироваться к неблагоприятной           обстановке. Восприятие клеткой внешнего сигнала о  «неблагополучии»               запускает сигнальные системы,  ведущие к экспрессии генов,  продукты              которыхнеобходимы для репарации повреждений,  восстановления гомеостаза и акклимации к новым условиям.  Известно,  что АФК в сигнальных системах играют большую роль при стрессе.Роль пероксида водорода как вторично             гомессенджера была подтверждена во многих случаях,  связанных с                       экспрессией генов,  контролирующих синтез ферментов-антиоксидантов,  а также синтез аскорбата и глутатиона. Есть данные,  что индукция                      антиоксидантной защиты может быть вызвана генерацией О₂^•- или Н₂О₂ в               апопласте [31].