Стовбурові клітини: перспективи застосування в лабораторній та медичній практиці

Ж-л «Генетика і Бітехнологія» Т. 1, № 2, 2012 
С. 69-74, Бібліогр. 7, укр. 
УДК 578.245:577.1113.7:57.086.833

Стовбурові клітини: перспективи  застосування в лабораторній та медичній практиці

Нобелівська премія в галузі медицини і фізіології за 2012 рік була присуджена за відкриття методу перетворення диференційованих клітин організму назад у стовбурові клітини. Неможливо переоцінити  значення цього відкриття для  медицини і фармації. Тепер із тканин пацієнта з певною хворобою можна  виділити необхідні клітини та перетворити  їх у клітини будь-яких інших тканин. Отримані подібним чином тканини  можна використовувати з терапевтичною  метою або вивчати на них дію  нових лікарських засобів. 

8 жовтня Нобелівська асоціація  Каролінського інституту, Стокгольм,  оголосила володарів Нобелівської  премії за 2012 рік з фізіології  та медицини. Ними стали професор  Кембріджського університету Джон  Б. Гердон (John B. Gurdon) і професор  Кіотського університету Сінья  Яманака (Shinya Yamanaka), яким вдалося  спростувати тезу в біології  індивідуального розвитку про  необоротність клітинної диференціації.

У 1962 році Дж. Гердон замінив ядро яйцеклітини  жаби на ядро диференційованої клітини  кишечника. Модифікована яйцеклітина  розвинулася в нормального пуголовка. Це довело факт, що в генетичному  матеріалі диференційованої зрілої клітини зберігається вся інформація, необхідна для розвитку цілого організму. Спочатку відкриття Дж. Гердона було скептично сприйняте, але через  деякий час його результати повторили  інші вчені. Це поклало початок дослідженням, які в кінцевому рахунку призвели до клонування ссавців. Однак у експерименті Дж. Гердона ядро зрілої клітини  за допомогою мікроманіпуляцій поміщалося в цитоплазму зародкової клітини. Тривалий час було відкрите питання, чи можна  інтактну диференційовану клітину  повернути у стовбурову.

На це питання зміг відповісти Сінья  Яманака. Своє дослідження він проводив на культурі in vitro стовбурових клітин мишей, ізольованих Мартіном Евансом (Martin Evans; Нобелівська премія 2007 року). С. Яманаці вдалося знайти низку  генів, які зберігали клітини  в недиференційованому стані. Коли деякі з цих генів були розшифровані, він спробував використовувати їх для повернення зрілої клітини в плюрипотентний стан. С. Яманака з колегами перебрали низку комбінацій генів, які вводили у фібробласти сполучної тканини. У результаті була знайдена комбінація з 4 генів, що здатна перетворювати фібробласти в стовбурові клітини. 

Відкриття Дж. Гердона поклало початок  напрямку масштабної області досліджень по трансферу ядер соматичних клітин (somatic cell nuclear transfer - SCNT), які дозволили  зрозуміти механізми диференціації  та клітинної спеціалізації. У 1997 році Іеном Вільмутом (Ian Wilmut) і Кітом  Кемпбелом (Keith Campbell) був отриманий  перший приголомшливий результат - народження вівці Доллі в результаті SCNT із клітини епітелію молочних залоз  в яйцеклітину. Стратегія експерименту І. Вільмута та К. Кемпбела грунтувалася на методиці Дж. Гердона з амфібіями  з низкою модифікацій. З часу народження Доллі в 1997 році за допомогою SCNT-методики були отримані клони багатьох видів  ссавців, включаючи мишу, корову, свиню, вовка і крупних кошачих. У 2002 році були отримані миші, клоновані  із ядра В- і Т-лімфоцитів. Це стало  доказом того, що навіть такі високоспеціалізовані клітини, які протягом життя набувають  істотних епігенетичних змін, несуть у собі потенціал для розвитку повноцінного організму.

Подальший розвиток досліджень у області  плюрипотентності пов'язаний з роботами С. Яманаки. Його лабораторія зосередилася на факторах, необхідних для підтримки  плюрипотентності у стовбурових  ембріональних клітинах. У результаті С. Яманаці вдалося ідентифікувати ген плюрипотентності Nanog, а також 24 транскрипційні фактори, присутні у  стовбурових клітинах, які гіпотетично  мають відношення до плюрипотентності. Також лабораторією С. Яманаки було встановлено, що злиття цитоплазми стовбурових  і соматичних клітин викликає повернення останніх у плюрипотентний стан. 

Потім С. Яманакою були розшифровані генетичні послідовності, які кодують  відкриті ним фактори транскрипції, що мають відношення до плюрипотентності, і проведений експеримент, в якому  дані 24 гени за допомогою ретровірусних  векторів вводили у фібробласти  шкіри. У деяких випадках фібробласти  утворювали колонії, що нагадують культуру стовбурових клітин. Потім С. Яманака з колегами видаляли низку генів у різних комбінаціях. Таким чином, кількість факторів транскрипції, необхідних для повернення диференційованих клітин в стан плюрипотентних стовбурових клітин, було скорочено до 4 (Myc, Oct3/4, Sox2 і Klf4). Отримані подібним чином клітини були названі С. Яманакою індукованими стовбуровими плюрипотентними клітинами (induced pluripotent stem cells - iPS cells). 

У початкових експериментах iPS-клітини  з'являлися з дуже низькою частотою. Однак, увівши в геном мишей, яких використовували для отримання iPS-клітин, ген стійкості до неоміцину, вдалося  отримати культуру таких клітин. (Експресія  цього гену активувалася лише в iPS-клітинах, але не в диференційованих, відповідно iPS-клітини набували стійкості до даного антибіотика).

Отримані iPS-клітини вводили у  бластоцисту химерних мишей (метод  отримання лабораторних тварин, при  якому in vitro вирощують ембріони до стадії 8 бластомерів, потім агрегують клітини  ембріонів від різних донорів  та вирощують in vitro ембріон до стадії бластоцисти, після чого підсаджуть у матку). У результаті спостерігали розвиток багаточисельних видів  тератом. Тим не менше, у першому  дослідженні С. Яманаці не вдалося  отримати стабільну культуру iPS-клітин. Це завдання було виконане в 2007 році, коли групі С. Яманаки, паралельно з групами  Рудольфа Джеєніша (Rudolf Jaenisch - один із піонерів клонування) і Конрада Хохендлігера (Konrad Hochedlinger), вдалося удосконалити систему відбору, і вони змогли створити стабільну лінію iPS-клітин. У тому ж році паралельно лабораторіям С. Яманаки  і Джеймса Томсона (James Thomson) вдалося  вперше отримати iPS-клітини людини. При цьому С. Яманакою були використані  гени тих же 4 факторів транскрипції, що і при експериментах на мишах (Myc, Oct4, Sox2 і Klf4), тоді як Дж. Томсон використовував дещо іншу комбінацію транскрипційних  факторів (Lin28, Nanog, Oct4 і Sox2).

Зроблене Дж. Гердоном і С. Яманакою відкриття дало новий імпульс  дослідженням в області трансдиференціювання - безпосередньому перетворенню одного типу клітин у інший, минувши стадію iPS-клітин. Ці дослідження були розпочаті  ще в 1960-ті роки в експериментах із імагінальним диском дрозофіли (зачаток  майбутнього органа в личинках і  лялечках комах, що має форму диска і складається із декількох шарів доволі однорідних епітеліальних клітин, розташованих навколо вузького просвіту). У той час вдалося перетворити фібробласти в міобласти за допомогою активації єдиного гена (який був названий MyoD).

Однак лише після досліджень С. Яманаки, модифікуючи його методику пошуку транскрипційних  факторів, відповідальних за диференціацію, вдалося отримувати стабільні результати. Так, була показана можливість перетворення екзокринних клітин підшлункової залози в ендокринні, а фібробластів - у  кардіоміоцити. Також була продемонстрована можливість зміни диференціації  тканин, які розвиваються навіть із різних зародкових листків: так, із фібробластів (мезодерма) були отримані нейробласти (ектодерма). У даному році з'явилися  перші дані про успішну зміну  трансдиференціації клітин ссавців in vivo.

Із застосуванням стовбурових  клітин, як і з можливостями трансдиференціювання, пов'язані певні надії фармацевтів і лікарів. iPS-клітини гіпотетично можуть бути використані для заміни хворих клітин при низці дегенеративних хвороб, наприклад хворобі Паркінсона або цукровому діабеті І типу. Також існує можливість за допомогою iPS-клітин подолати проблему імунного відторгнення органів при трансплантаціях. Втім, практичне використання iPS-клітин - справа минулого. Щоб подібні методики знайшли застосування в клінічній практиці, потрібно значно покращити і здешевити методики вирощування iPS-клітин.

Також викликають питання проблеми безпеки. Застосовувані в даний  час для отримання iPS-клітин процедури  потенційно можуть викликати мутації  та інші генетичні порушення, що обмежує  використання iPS-клітин для терапії. Одним словом, хоча застосування iPS-клітин у медицині відкриває фантастичні  горизонти, потрібні подальші дослідження  для доказу безпеки цього методу терапії.

Інша, більш реалістична перспектива - дослідження низки генетичних хвороб та хвороб із генетичною схильністю. Отримавши  від пацієнтів культуру iPS-клітин, можна краще зрозуміти процеси, які викликають хворобу, а також  проводити на цих культурах токсикологічні дослідження нових лікарських засобів. У даний час вже отримані культури iPS-клітин від пацієнтів із аміотрофним латеральним склерозом, синдромом Ретта, спінальної м'язової атрофії, недостатністю антитрипсина α1, сімейною гіперхолестеринемією та хворобою Гірке (глікогеноз I типу з дефектом глюкозо-6-фосфатази).

Уже зараз культури iPS-клітин використовуються в дослідженнях у області кардіології  для вивчення синдрому подовженого  інтервалу Q-T I і II типів.

Також на iPS-клітинних моделях хвороб були виявлені зв'язки між фенотипом  клітинної культури і хворобою. Наприклад, у нейробластів, вирощених із iPS-клітин, отриманих від хворих на аміотрофний  латеральний склероз, відмічається прогресивне зменшення рухливості, а у нейробластів із iPS-клітин, отриманих  від хворих на синдром Ретта, було виявлено зменшення розмірів дендритних відростків. Гепатоцити отримані із iPS-клітин хворих на хворобу Гірке, показали надлишкове накопичення глікогену та жирів.

Виявлена закономірність дозволяє передбачати, що культури iPS-клітин можуть бути успішно використані для  моделювання хвороб з пізнім розвитком, таких як хвороба Альцгеймера, спіноцеребральна атаксія та хвороба Хантінгтона.

Також певний прогрес був досягнутий при вивченні хвороб зі складною генетикою, наприклад, шизофренії.

При дослідженні iPS-клітинної моделі сімейної дизавтономії була знайдена нова активна речовина, названа кінетин, яка частково зменшує порушення сплайсингу гена IKBKAP (що викликає хворобу). Також на iPS-клітинній моделі була доведена нормалізація фенотипу клітин при призначенні блокаторів бета-адренорецепторів та блокаторів йонних каналів при синдромі збільшення інтервалу Q-T.

Таким чином, зроблене Дж. Гердоном і  С. Яманакою відкриття уже закріпилося  якщо не в клінічній, то в лабораторній практиці. Культури iPS-клітин успішно  використовуються в якості скринінгових платформ для розробки і тестування нових лікарських засобів.

Проте, це лише початок великого шляху. Шляху, який показує для науки  відкриття, що довело можливість повернення зрілих клітин у їх ембріональне дитинство.

Нові способи  використання стовбурових клітин

Вчені відкрили новий  тип стовбурових клітин, які допоможуть відновлювати кінцівки

20 листопада 2012 в 08:28

Новий тип стовбурових  клітин, яким учені дали ім'я «умовно-перепрограмовані клітини» (CRC,) мають намір використовувати  для вирощування тканин пошкоджених  органів або лікування діабету.

Американські біологи  відкрили новий тип стовбурових клітин, не схожий за своїми властивостями і методом отримання на ембріональні і «перепрограмовані» клітини, які можна буде використовувати для відновлення кінцівок і органів без небезпеки отримати ракову пухлину.

"Можливо, ми зможемо  використовувати їх для вирощування тканин для пошкоджених органів або лікування діабету. Зокрема, ми можемо витягувати залишки інсулінових острівців з підшлункової залози, збільшувати їх і пересаджувати назад в тіло людини. Аналогічна методика може застосовуватися для лікування вроджених хвороб печінки. В таких випадках ми можемо витягти клітини печінки, вставити в них нормальні гени, розмножити і повернути їх законному власникові", - заявив керівник групи Річард Шлегель з Медичного центру при університеті Джорджтауна (США).

 Шлегель і його колеги проводили експерименти з різними лініями здорових і ракових клітин, вивчаючи їхню реакцію на появу різних гормонів та білків у живильному середовищі.

У грудні минулого року автори статті розробили методику, яка відключає  механізми захисту в здорових клітинах і дозволяє їм необмежено ділитися, що дуже схоже на поведінку  культур стовбурових клітин.

У новій роботі група під  керівництвом Шлегеля вивчила властивості  клітин в таких культурах і  порівняла їх з ембріональними і "перепрограмувала" стовбуровими клітинами.

Для цього вчені зібрали  зразки "дорослих" клітин зі стінок шийки матки і помістили їх у живильне середовище. Потім вони додали в неї два ключові компоненти - клітини-"няньки" зі сполучної  тканини людини, а також спеціальний  фермент, що перешкоджає роботі механізму  клітинного самознищення.

Біологи дозволили клітинам ділитися протягом кількох поколінь, після чого порівняли вміст їхньої цитоплазми з набором з білків, РНК та інших органічних молекул у стовбурових клітинах.

Виявилося, що клітини з  культур були дуже схожі не на базові стовбурові клітини, здатні перетворитися  на будь-який вид тканин тіла, а на їхніх нащадків - клітини-"заготовки", які становлять основу майбутньої шийки  матки в людському зародку. 

Зі слів вчених, такі клітини  безпечні з точки зору розвитку раку – у них відключені гени росту  і розвитку, що вважаються основною причиною розвитку пухлин.

Клітини Шлегеля і його колег володіють і іншою цікавою  властивістю - вони "згадували" свою попередню роль через три дні  після того, як вчені переставали  додавати в живильне середовище суміш  з клітин-"няньок" і ферменту.

В результаті цього процесу  на стінках чашки Петрі виростала  тканина з кількох шарів клітин, аналогічних тим, які зустрічаються  в шийці матки.

Вчені повторили свої досліди  на клітинах, витягнутих з шкіри  рук і тканин легенів, і отримали аналогічні результати. З їхніх слів, подібна універсальність методики дозволяє сподіватися на те, що даний  тип клітин, яким учені дали ім'я "умовно-перепрограмовані клітини" (CRC), знайде широке застосування в регенеративній медицині.

"Схоже, що це той  самий вид клітин, який потрібен  для того, щоб перетворити регенеративну  медицину з мрії на реальність", - резюмував Шлегель. 

Японські і  американські медики успішно провели  операції з пересадки штучних  багатофункціональних стовбурових  клітин неембріонального походження.