Сущность свободных радикалов в природе и их взаимодействие с антиоксидантами

Радикалы обладают высокой реакционной способностью, и изучать их обычны ми химическими методами невозможно: стандартные процедуры вроде хроматографии или центрифугирования бесполезны. Биохимические анализы позволяют, правда, определять конечные продукты реакций, в которых предполагается участие радикалов, но всегда остается вопрос, а действительно ли радикалы участвовали в процессе и какие именно. Важную роль при решении таких вопросов играет так называемый ингибиторный анализ. Классическим примером может служить применение фермента супероксиддисмутазы (СОД). Этот фермент, открытый Дж. Мак-Кордом и И. Фридовичем около тридцати лет назад, катализирует реакцию взаимодействия (дисмутации) двух супероксидных радикалов с образованием перекиси водорода и молекулярного кислорода. Открытие СОД совершило революцию в умах биохимиков: раз есть фермент, удаляющий кислородные радикалы и специально вырабатываемый живыми клетками (и, как выяснилось, чрезвычайно широко распространенный в живой природе), то ясно, что и сами радикалы существуют в природе и почему-то их надо обязательно удалять. Постепенно СОД стали широко использовать во всех исследованиях, где изучают роль супероксида в том или ином процессе, будь то индивидуальная биохимическая реакция или развитие болезни у лабораторных животных или человека. Если добавление СОД тормозит изучаемый процесс, значит, для его протекания необходим супероксид-радикал. Остается выяснить, в какой именно реакции этот радикал участвует. Ингибиторный анализ исполь зуют и для изучения реакций с участием других радикалов. Так, для выяснения участия в каком-нибудь процессе реакций цепного окисления липидов используют жирорастворимые ловушки липидных радикалов, которые "ведут" цепи окисления. К числу таких ловушек относятся токоферол (витамин Е) и некоторые синтетические соединения, например трет-бутилгидроксито-луол (ионол). Водорастворимые радикалы эффективно перехватываются аскорбиновой или мочевой кислотой. Для улавливания радикалов гидроксила (HO*)используют маннитол или бензойную кислоту, а иногда этанол. Надо, однако, сказать, что далеко не всегда ловушки специфичны: многие из них реагируют не только с радикалами, но и с достаточно активными молекулами.

Методы биофизики. Прямой метод изучения свобод ных радикалов — это метод электронного парамагнитно го резонанса (ЭПР) [1]. По наличию, амплитуде и форме сигналов (спектров) ЭПР можно судить о существовании непарных электронов в образце, определять их концентрацию, а иногда и выяснить, какова химическая структура радикалов, которые эти непарные электроны содержат. Эффективным методом изучения реакций с участием радикалов оказался метод хемилюминесцен-ции (ХЛ) [2—4]. При взаимодействии радикалов друг с другом выделяется много энергии, которая может излучаться в виде квантов света. Интенсивность такого свечения (ХЛ) пропорциональна скорости реакции, в которой участвуют радикалы, и, следовательно, показывает изменение их концентрации по ходу реакции.

Надо отметить, что чувствительности этих методов часто бывает недостаточно. В биологических системах скорости образования радикалов кислорода или липидных радикалов в мембранах не так уж велики, зато очень велики скорости исчезновения этих радикалов, поэтому концентрация радикалов в каждый данный момент времени обычно мала. Выход из положения заключается в использовании так называемых спиновых ловушек в методе ЭПР и активаторов свечения в методе хемилюминесценции. В первом случае к изучаемому образцу (например, к суспензии клеток, гомогенату ткани или раствору, где протекают реакции с участием свободных радикалов) добавляют особые вещества, называемые спиновыми ловушками. Например, для за хвата радикалов гидроксила HO* используют фенилбу-тилнитрон (ФБН При взаимодействии ловушки с радикалом происходит присоединение радикала к ловушке с образованием нового, стабильного радикала, получившего название спинового аддукта (от англ. add — добавлять, складывать). Сигналы ЭПР спиновых аддуктов разных радикалов слегка различаются по форме. Это позволяет идентифицировать радикалы, образующиеся в изучаемой системе. Для улавливания других радикалов используют другие ловушки.

Согласно предложенной нами классификации, большинство радикалов, образующихся в организме чело века, можно разделить на природные и чужеродные. Природные радикалы можно, в свою очередь, разделить на первичные, вторичные  и третичные (радикалы антиоксидантов). Образование первичных радикалов осуществляется при участии определенных ферментных систем. Эти радикалы выполняют полезные для организма функции. Из первичного радикала — супероксида, а также в результате других реакций в организме могут образоваться весьма активные молекулярные соединения: перекись водорода, гипохлорит и гидроперекиси липидов. Под действием ионов металлов переменной валентности, с первую очередь ионов Fe2+, из этих веществ образуются вторичные свободные радикалы, такие, как радикал гидроксила и радикалы липидов, которые оказывают разрушительное действие на клеточные структуры.

Радикалы кислорода. Человеку, как и всякому многоклеточному организму, приходится бороться с микробами, случайно попавшими внутрь его тела в кровь. Эту борьбу ведут специализированные клетки — фагоциты, к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые клетки — макрофаги. Все эти клетки, соприкасаясь с поверхностью клеток бактерий, начинают энергично выделять свободные радикалы в результате переноса электрона от НАДФН-оксидазного ферментного комплекса, встроенного в мембраны фагоцита, на растворенный молекулярный кислород

 

НАДФН + 2O=O —► НАД+ + 2COO") (супероксид анион-радикал).

 

При этом каждая молекула НАДФН, окисляясь, отдает один за другим два электрона двум молекулам кислорода, в результате чего образуется два анион-радикала супероксида.

Супероксид-радикалы могут нанести вред как самим фагоцитам, так и другим клеткам крови и, разумеется, микробам, вызвавшим активацию макрофага. Естественно, что все эти клетки стараются избавиться от супероксид-радикалов, для чего они вырабатывают ферменты, называемые супероксиддисмутазами (СОД). Различаясь по строению активного центра и структуре полипептидной цепи, все СОД катализируют одну и ту же реакцию дисмутации супероксидного радикала:

При этом супероксид превращается в кислород и перекись водорода. Судьба последней может быть разной.

В норме фагоциты используют перекись водорода для синтеза гипохлорита, выделяя специальный фермент — миелопероксидазу (МП). Миелопероксидаза катализирует реакцию:

Гипохлорит разрушает стенку бактериальной клетки и тем самым убивает бактерии. Перекись водорода диффундирует в клетки, но там разрушается в результате

Радикал коэнзима Q. На конечном этапе окисления субстратов в клетках электроны переносятся от НАДН и либо при одноэлектронном восстановлении на Q на рис. 1:

Рисунок 1 – Схема дыхательной цепи

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии, и следует остановиться на ее механизме [3]. Реакция протекает в несколько стадий, которые получили название "инициирование", "продолжение", "разветвление" и "обрыв" цепи.

Рассмотрим эти стадии подробнее. Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран или липопротеинов внедряется свободный радикал. Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образуются липидные радикалы:

 

HO^ + LH —► H2O +

 

Чередование двух последних реакций и представляет собой цепную реакцию пероксидации (перекисного окисления) липидов (см. рис. 3, вверху). Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в при сутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом Образующиеся радикалы LO^ инициируют новые цепи окисления липидов (см. рис. 3, внизу):

 

LO^ + LH —► LOH + L^; + O2 —► LOO^ и т.д.

 

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов перемен ной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом:

 

LOO^ + Fe2+ + H+ —► LOOH,

LOO^ + InH —► br

LOO^ + LOO^ —► молекулярные продукты.

 

Последняя реакция особенно интересна, поскольку она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность сверхслабого свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале, и измерение хемилю-минесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах [2—4].

 

1.4 Свободные радикалы и окислительный процесс

 

В настоящее время признано, что окислительное повреждение различных макромолекул (нуклеиновых кислот, белков, липидов) – это главный фактор, который обуславливает старение организма и, в частности, кожи. При чрезмерном накоплении в клетках и тканях кожи активных форм кислорода – свободных радикалов с наибольшей повреждающей способностью – происходит повреждение и, в прямом смысле, укорочение жизни клеток [6].

Окисление – это не что иное, как передача электрона от атома одного вещества к атому другого, являющегося окислителем. Окислитель, приняв электрон, восстанавливается.

Кислород – главный окислитель в природе, но еще более сильным окислительным действием обладают его свободнорадикальные активные формы.

Свободные радикалы – атомы и молекулы с неспаренным электроном, обладающие высокой реакционной способностью. Они чрезвычайно активно вступают в химические реакции, поскольку имеют свободное место для электрона, который пытаются «отнять» у других веществ.  если это удается, восстановленный радикал становится неактивным, но зато окисленное (лишенное электрона) вещество становится агрессивным радикалом. В результате ранее инертные вещества начинают активно вступать в химические реакции.

Например, в окисленной ДНК радикалами могут стать даже две части одной нити. Повреждения же в молекулах ДНК становятся причиной гибели или еще хуже – ракового перерождения клеток [1].

Свободные радикалы появляются как побочный продукт восстановления молекулярного кислорода до воды, которое осуществляется как в процессе нормального дыхательного цикла в митохондриях, так и в результате агрессивного влияния экзогенных факторов (уФ-излучения, радиоактивного излучения и т.д.) и веществ (прооксидантов). Радикальные формы кислорода (свободные радикалы) и, прежде всего, супероксид-анион и гидроксидрадикал, обладая свободным местом для электрона, могут быть окислителями (первый – слабым, второй – очень сильным). Реакции с участием радикалов в организме обычно называют свободнорадикальным окислением.

При чрезмерной активации этих реакций возникает окислительный стресс.Основные причины, приводящие к активации свободнорадикального окисления в тканях:

- уменьшение поступления в организм экзогенных антиоксидантов (токоферола, аскорбиновой кислоты, биофлавоноидов и др.);

- стресс различного происхождения;

- поступление в организм прооксидантов (пестицидов, лекарств-окислителей, фотохимических продуктов смога и т.д.);

- избыточное потребление  жиров и углеводов при недостаточном  их расходовании;

- гипокинезия;

- влияние физических факторов (уФ-излучения, электромагнитного поля и т.д.);

- возрастное уменьшение активности антиоксидантных ферментов;

- врожденные энзимопатии  антиоксидантных ферментов.[7].

Итак, следствием перекисного окисления липидов является повреждение макромолекул и мембран. Это приводит к нарушению барьерной и других функций клеточных мембран, к разобщению процессов окисления и фосфорилирования на мембранах митохондрий. Дефицит энергии отражается на всех процессах, включая пролиферацию, дифференцировку клеток, синтез различных веществ. Страдают не только клетки всех слоев кожи, но и межклеточного вещества. Повреждение белков ферментов ведет к нарушению метаболизма в клетке и межклеточном пространстве, поврежденные свободными радикалами клеточные ферменты уже не могут полноценно управлять химическими превращениями в клетках. Нарушается природная конформация белковых молекул и функциональное взаимодействие белков друг с другом. Окисленные белки начинают неправильно реагировать на внутриклеточные сигналы, их ошибки становятся опасными для клеточного метаболизма.

Причем эти процессы протекают в клетке даже при незначительном накоплении свободных радикалов.

Окисленные свободными радикалами молекулы коллагена, сами превратившись в активные радикалы, могут связываться друг с другом, образуя димеры. «Сшитый» коллаген становится менее эластичным, накопление же коллагеновых димеров ведет к старению кожи и возникновению морщин. Кроме того, увеличивающееся число межмолекулярных связей повышает содержание коллагена, резистентного к действию энзимов [4, 11].