Транскрипция у прлокариот

в) Регуляція експресії лактозното оперона

Розглянемо позитивну і негативну регуляцію лактозного оперона

- Негативна регуляція лактозного оперону. Бактерії Є. coli можуть використовувати як єдине джерело вуглецю та енергії лактозу, оскільки вони здатні утворювати у великій кількості β-галактозидазу-фермент, що розщеплює лактозу на глюкозу і галактозу. Однак при зростанні на інших джерелах вуглецю в клітинах E.coli утворюється дуже мало β-галактозидази. Ген, відповідальний за синтез β-галактозидази (lac Z), називається індуцибельних, оскільки кодується їм фермент синтезується тільки тоді, коли в клітці присутні цукру, що мають β-галактозільние залишки. Крім β-галактозидази, β-галактозид індукують утворення ще двох білків: (β-галактозідпермеази (кодируемой геном lacY), необхідної для проникнення β-галактозид в клітку, і β-галактозідтрансацетілази (lac А), ферменту з нез'ясованої поки функцією (прозрачка 5 ). У цих трьох генах-lac Z, lacY і lac А-міститься вся інформація про білки, що кодуються lac-опероном. Вони транскрибуються в єдину Поліцистронна РНК, при трансляції якої утворюються майже однакові кількості відповідних білків. Тому можна сказати, що три гени lас-оперону експресуються узгоджено.

Зі структурними генами lac-оперону пов'язані кілька типів регуляторних елементів, відповідальних за індуцибельних і координовану регуляцію цих генів (прозрачка 5). Промотор - це нуклеотидна послідовність, з якою зв'язується РНК-полімераза і починається транскрипція трьох структурних генів. Оператор - це сайт, з яким пов'язується lac-репрессор, що пригнічує транскрипцію lас-оперону. Ген 1асI, що не входить до складу lас-оперону, кодує репрессор - поліпептидний ланцюг з мовляв. масою 37 000 Да. Репрессор міцно зв'язується з оператором, перебуваючи в тетрамерной формі.

Оскільки промоторних і операторна послідовності перекриваються, зв'язування репрессора з оператором заважає зв'язування РНК-полімерази з промотором, що призводить до блокування транскрипції структурних генів. Транскрипцію оперона можна індукувати, якщо блокувати зв'язування репрессора з оператором (прозрачка 6). Таке блокування відбувається при зв'язуванні одного з β-галактозид з тією чи іншою субодиницею репрессора, що зменшує спорідненість останнього до оператора. Після від'єднання репрессора від промотра полімераза може зв'язатися з промотором і ініціювати транскрипцію оперону.

Дуже важливе збереження нуклеотидної послідовності домену lас-оператора, що зв'язує репрессор. Про це свідчать результати дослідження ефективності репресії in vivo у мутантів з модифікованими репрессором або операторами (прозрачка 7). Цікаві дані були отримані і при вивченні зв'язування очищених репрессорних білків з операторами дикого типу та мутантними формами in vivo. Мутації, що зменшують спорідненість репрессора до оператора, приводили до конститутивним синтезу ферментів, що кодуються lac-опероном, тобто до експресії lас-ферментів за відсутності індуктора. Мутації, що супроводжуються накопиченням репрессора в клітках або збільшенням спорідненості репрессора до оператора, робили lас-оперон неіндуцібельним.

- Позитивна регуляція лактозного оперону. Для експресії lас-оперону, як і інших індуцибельних Оперон, які здійснюють контроль синтезу ферментів, що беруть участь у метаболізмі Цукор, необхідно не тільки зняти репресію оперона, але й отримати певний сигнал; Таким сигналом служить комплекс циклічного АМР (сАМР) з білком-активатором катаболізму (CAP, від англ. catabolite activator protein), який зв'язується із специфічною послідовністю, що знаходиться на самому початку lac-промотора (прозрачка 8).

· САМР, що приймає участь в багатьох клітинних процесах, утворюється з АТР (прозрачка 8а) у відповідь на самі різні поза - і внутрішньоклітинні події.

· САР представляє собою димер з ідентичних поліпептидних ланцюгів з мовляв. масою 22 кДа.

Зв'язування комплексу САР-Самро зі специфічною послідовністю на початку промотора призводить до посилення транскрипції lac-оперону майже в 50 разів. Сам по собі CAP не здатний до такого зв'язування і стимуляції транскрипції. Посилення транскрипції за допомогою комплексу САР-Самро можна пояснити:

1) зв'язуючись з ДНК в безпосередній близькості від сайту приєднання РНК-полімерази, він посилює спорідненість цього ферменту до промотор (прозрачка 9).

2) Альтернативна гіпотеза полягає в тому, що зв'язування САР-Самро з САР-сайтом запобігає приєднання РНК-полімерази до розташованого поблизу слабкому промотор і збільшує тим самим ймовірність того, що полімераза зв'яжеться з «правильним» промоторні сайтом. Раніше висловлювалися припущення, що комплекс САР-Самро змінює топологію ДНК, так що полегшуються зв'язування полімерази і транскрипція, здається неспроможним.

Комплекс САР-Самро є позитивним сигналом при регуляції експресії та інших Оперон, зокрема тих, які кодують ферменти розщеплення вуглеводів (галактозним і арабінозний оперон) а також роботу Оперон, що кодують ферменти, які беруть участь у деградації амінокислот, пуринів і піримідинів.

Комплекс САР-Самро при регуляції експресії галактозним і арабінозного Оперон

Комплекс САР-Самро є позитивним сигналом при регуляції експресії цих Оперон (галактозним і арабінозного). Наприклад, для експресії ara-і gal-onepонов повинні відбутися дерепресія за допомогою індукторів - арабінози і галактози відповідно і зв'язування комплексу САР-Самро з областю промотора. Так, у бактерій, що ростуть на глюкозі, рівень внутрішньоклітинного сАМР і відповідно комплексу САР-Самро дуже низький. Тому, якщо навіть у середовищі присутня арабіноза або галактоза, в клітинах не утворюються ферменти, необхідні для утилізації цих цукрів. При зменшенні кількості глюкози рівні сАМР і САР-Самро збільшуються і оперон в присутності необхідних індукторів починають експресуватися. Подібна комбінація позитивної та негативної систем регуляції дуже важлива, оскільки це запобігає утворення ферментів, потреба в яких в даний момент відсутня.

Комплекс САР-Самро при регуляції експресії ферментів, які беруть участь у деградації амінокислот, пуринів і піримідинів

Сигнальна система САР-Самро регулює також роботу Оперон, що кодують ферменти, які беруть участь у деградації амінокислот, пуринів і піримідинів. Накопичення в клітці САР-Самро служить сигналом "голодування": у відповідь на нього знижується експресія Оперон, що кодують ферменти розщеплення амінокислот, пуринів і піримідинів. У цьому випадку логіка роботи системи також полягає в тому, щоб запобігти утворенню непотрібних ферментів у період голодування.

г). Регуляція експресії триптофанового оперона

Триптофанового оперон складається з оператора, і п'яти структурних генів (А-Е). Останній кодує ферменти, які беруть участь у біосинтезі триптофану - однієї з незамінних ам.к. по мірі збільшення концентрації триптофану настає момент, коли його подальший синтез стає небажаним і транскрипція припиняється.

Триптофан синтезується в Е.соli з ароматичного попередника - хорізмовой кислоти - в ході п'яти послідовних реакцій, що каталізуються ферментним комплексом з п'яти білків (прозрачка 10, 2). Ці кодуються trp-опероном білки утворюються узгоджено, приблизно в рівних кількостях, при трансляції Поліцистронна мРНК довжиною 7000 нуклеотидів, транскрибуються з промотора. При наявності в середовищі достатнього для зростання бактерій кількості триптофану клітини Є. coli утворюють ферменти біосинтезу триптофану в дуже малих кількостях. Однак якщо клітини позбавлені екзогенного триптофану, то в них починається досить інтенсивний синтез всіх п'яти ферментів. Зміст ферментів цієї групи в клітинах Е.соli може розрізнятися до 700 разів залежно від внутрішньоклітинного рівня триптофану.

Такий порядок у рівні експресії обумовлений наявністю двох практично незалежних механізмів регуляції, кожен з яких «підганяє» рівень синтезу trp-мРНК до концентрації внутрішньоклітинного триптофану.

Механізми: їх два. Ефекти цих двох регуляторних механізмів комплементарні, мультиплікативний і дозволяють збільшувати ступінь експресії оперону.