Ферменты, их свойства

Ýòî âîçìîæíî ëèøü ïîòîìó, ÷òî â êëåòî÷íîì ñîäåðæèìîì ôåðìåíòû ðàñïðåäåëåíû íå õàîòè÷åñêè, à ñòðîãî óïîðÿäî÷åííî. Ñ ñîâðåìåííîé òî÷êè çðåíèÿ êëåòêà ïðåäñòàâëÿåòñÿ âûñîêîîðãàíèçîâàííîé ñèñòåìîé, â îòäåëüíûõ ÷àñòÿõ êîòîðîé îñóùåñòâëÿþòñÿ ñòðîãî îïðåäåëåííûå áèîõèìè÷åñêèå ïðîöåññû.  ñîîòâåòñòâèè ñ ïðèóðî÷åííîñòüþ èõ ê îïðåäåëåííûì ñóáêëåòî÷íûì ÷àñòèöàì èëè îòñåêàì (êîìïàðòìåíòàì) êëåòêè â íèõ ëîêàëèçîâàíû òå èëè èíûå èíäèâèäóàëüíûå ôåðìåíòû, ìóëüòèýíçèìíûå êîìïëåêñû, ïîëèôóíêöèîíàëüíûå ôåðìåíòû èëè ñëîæíåéøèå ìåòàáîëîíû.

Ðàçíîîáðàçíûå ãèäðîëàçû è ëèàçû ñîñðåäîòî÷åíû ïðåèìóùåñòâåííî â ëèçîñîìàõ. Âíóòðè ýòèõ ñðàâíèòåëüíî íåáîëüøèõ (íåñêîëüêî íàíîìåòðîâ â äèàìåòðå) ïóçûðüêîâ, îãðàíè÷åííûõ ìåìáðàíîé îò ãèàëîïëàçìû êëåòêè, ïðîòåêàþò ïðîöåññû äåñòðóêöèè ðàçëè÷íûõ îðãàíè÷åñêèõ ñîåäèíåíèé äî òåõ ïðîñòåéøèõ ñòðóêòóðíûõ åäèíèö, èç êîòîðûõ îíè ïîñòðîåíû. Ñëîæíûå àíñàìáëè îêèñëèòåëüíî-âîññòàíîâèòåëüíûõ ôåðìåíòîâ, òàêèå, íàïðèìåð, êàê öèòîõðîìíàÿ ñèñòåìà, íàõîäÿòñÿ â ìèòîõîíäðèÿõ.  ýòèõ æå ñóáêëåòî÷íûõ ÷àñòèöàõ ëîêàëèçîâàí íàáîð ôåðìåíòîâ öèêëà äèêàðáîíîâûõ è òðèêàðáîíîâûõ êèñëîò. Ôåðìåíòû àêòèâèðîâàíèÿ àìèíîêèñëîò ðàñïðåäåëåíû â ãèàëîïëàçìå, íî îíè æå åñòü è â ÿäðå.  ãèàëîïëàçìå ïðèñóòñòâóþò ìíîãî÷èñëåííûå ìåòàáîëîíû ãëèêîëèçà, ñòðóêòóðíî îáúåäèíåííûå ñ òàêîâûìè ïåíòîçîôîñôàòíîãî öèêëà, ÷òî îáåñïå÷èâàåò âçàèìîïåðåêëþ÷åíèå äèõîòîìè÷åñêîãî è àïîòîìè÷åñêîãî ïóòåé ðàñïàäà óãëåâîäîâ.  òî æå âðåìÿ ôåðìåíòû, óñêîðÿþùèå ïåðåíîñ àìèíîêèñëîòíûõ îñòàòêîâ íà ðàñòóùèé êîíåö ïîëèïåïòèäíîé öåïè è êàòàëèçèðóþùèå íåêîòîðûå äðóãèå ðåàêöèè â ïðîöåññå áèîñèíòåçà áåëêà, ñîñðåäîòî÷åíû â ðèáîñîìàëüíîì àïïàðàòå êëåòêè. Íóêëåîòèäèëòðàíñôåðàçû, óñêîðÿþùèå ðåàêöèþ ïåðåíîñà íóêëåîòèäíûõ îñòàòêîâ ïðè íîâîîáðàçîâàíèè íóêëåèíîâûõ êèñëîò, ëîêàëèçîâàíû â îñíîâíîì â ÿäåðíîì àïïàðàòå êëåòêè. Òàêèì îáðàçîì, ñèñòåìû ôåðìåíòîâ, ñîñðåäîòî÷åííûå â òåõ èëè èíûõ ñòðóêòóðàõ, ó÷àñòâóþò â îñóùåñòâëåíèè îòäåëüíûõ öèêëîâ ðåàêöèé. Áóäó÷è òîíêî êîîðäèíèðîâàíû äðóã ñ äðóãîì, ýòè îòäåëüíûå öèêëû ðåàêöèé îáåñïå÷èâàþò æèçíåäåÿòåëüíîñòü êëåòîê, îðãàíîâ, òêàíåé è îðãàíèçìà â öåëîì.

7. Ìåòîäû âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ôåðìåíòîâ

Äîëãîå âðåìÿ âïîëíå îáîñíîâàííî ñ÷èòàëè, ÷òî âñå ôåðìåíòû - òåëà áåëêîâîé ïðèðîäû. Îäíàêî â íà÷àëå 80-õ ãîäîâ áûëà íåîæèäàííî îòêðûòà ñïîñîáíîñòü íèçêîìîëåêóëÿðíûõ ðèáîíóêëåèíîâûõ êèñëîò óñêîðÿòü ðåàêöèþ ïðåâðàùåíèÿ ïðåäøåñòâåííèêîâ ÐÍÊ â ôóíêöèîíàëüíî çíà÷èìûé ïðîäóêò, ò. å. âîçíèêëî ïðåäñòàâëåíèå î ïîëèðèáîíóêëåîòèäíîé ïðèðîäå íåêîòîðûõ ôåðìåíòîâ, íàçâàííûõ ðèáîçèìàìè.

Õîòÿ óæå îñóùåñòâëåí ëàáîðàòîðíûé ñèíòåç ðÿäà ôåðìåíòîâ - ðèáîíóêëåàçû, ëèçîöèìà, ôåððåäîêñèíà è öèòîõðîìà ñ, òðóäíî îæèäàòü, ÷òî ñèíòåòè÷åñêîå ïîëó÷åíèå ôåðìåíòîâ ïîëó÷èò øèðîêîå ðàñïðîñòðàíåíèå â áëèæàéøèå äåñÿòèëåòèÿ ââèäó åãî ñëîæíîñòè è äîðîãîâèçíû, ïîýòîìó åäèíñòâåííûé ðåàëüíûé â íàñòîÿùåå âðåìÿ ñïîñîá ïîëó÷åíèÿ ôåðìåíòîâ - ýòî âûäåëåíèå èõ èç áèîëîãè÷åñêèõ îáúåêòîâ.

Âûäåëÿþò ôåðìåíòû òàê æå, êàê è äðóãèå áåëêè, õîòÿ åñòü ïðèåìû, ïðèìåíÿåìûå ïðåèìóùåñòâåííî äëÿ ôåðìåíòîâ. Èç íèõ ìîæíî îòìåòèòü ýêñòðàêöèþ ãëèöåðèíîì, â êîòîðîì ñîõðàíÿþòñÿ íàòèâíûå ñâîéñòâà ôåðìåíòîâ, à òàêæå ìåòîä àöåòîíîâûõ ïîðîøêîâ, ñîñòîÿùèé â îñàæäåíèè è áûñòðîì îáåçâîæèâàíèè ïðè òåìïåðàòóðå íå âûøå -10°Ñ òêàíåé èëè âûòÿæåê èç íèõ, ñîäåðæàùèõ ôåðìåíòû. Ê èõ ÷èñëó îòíîñèòñÿ òàêæå ïîëó÷åíèå ôåðìåíòîâ ïóòåì àäñîðáöèè ñ ïîñëåäóþùåé ýëþöèåé (ñíÿòèåì) ñ àäñîðáåíòà. Ýòîò ìåòîä áûë ââåäåí â õèìèþ ôåðìåíòîâ À. ß. Äàíèëåâñêèì è äàë ìîùíûé òîë÷îê ðàçâèòèþ ôåðìåíòîëîãèè. Ñåé÷àñ àäñîðáöèîííûé ìåòîä âûäåëåíèÿ è î÷èñòêè ôåðìåíòîâ ðàçðàáîòàí äåòàëüíî. Íàðÿäó ñ íèì øèðîêî ïðèìåíÿþò ìåòîä èîíîîáìåííîé õðîìàòîãðàôèè, ìåòîä ìîëåêóëÿðíûõ ñèò, ýëåêòðîôîðåç è îñîáåííî èçîýëåêòðîôîêóñèðîâàíèå. Îäíà èç ìîäèôèêàöèé àäñîðáöèîííîãî ìåòîäà - àôèííàÿ õðîìàòîãðàôèÿ, ãäå àäñîðáåíòîì ñëóæèò âåùåñòâî, ñ êîòîðûì ôåðìåíò âçàèìîäåéñòâóåò èçáèðàòåëüíî.  ðåçóëüòàòå ëèøü îäèí ýòîò ôåðìåíò çàäåðæèâàåòñÿ íà êîëîíêå, à âñå ñîïóòñòâóþùèå åìó âûõîäÿò ñ òîêîì ïðîÿâèòåëÿ. Èçìåíÿÿ õàðàêòåð ïðîÿâèòåëÿ, èññëåäóåìûé ôåðìåíò ýëþèðóåò ñ êîëîíêè. Ýòèì ìåòîäîì äîñòèãàþò î÷èñòêè ôåðìåíòà â íåñêîëüêî òûñÿ÷ ðàç, ïðèìåíÿÿ âñåãî ëèøü îäíîýòàæíóþ (àôôèííàÿ ñîðáöèÿ - ýëþöèÿ) ñõåìó âûäåëåíèÿ.

Äëÿ óñïåøíîãî âûäåëåíèÿ ôåðìåíòîâ èç êëåòî÷íîãî ñîäåðæèìîãî íåîáõîäèìî î÷åíü òîíêîå èçìåëü÷åíèå èñõîäíîãî ìàòåðèàëà, âïëîòü äî ðàçðóøåíèÿ ñóáêëåòî÷íûõ ñòðóêòóð: ëèçîñîì, ìèòîõîíäðèé, ÿäåð è äð., êîòîðûå íåñóò â ñâîåì ñîñòàâå ìíîãèå èíäèâèäóàëüíûå ôåðìåíòû. Îñîáîå âíèìàíèå ïðè âûäåëåíèè ôåðìåíòîâ óäåëÿþò ïðîâåäåíèþ âñåõ îïåðàöèé â óñëîâèÿõ, èñêëþ÷àþùèõ äåíàòóðàöèþ áåëêà, òàê êàê îíà âñåãäà ñâÿçàíà ñ ïîòåðåé ôåðìåíòàòèâíîé àêòèâíîñòè. Ýòîìó ñïîñîáñòâóåò ïðîâåäåíèå îïåðàöèé â ïðèñóòñòâèè çàùèòíûõ äîáàâîê, â ÷àñòíîñòè HS-ñîäåðæàùèõ ñîåäèíåíèé (öèñòåèíà, ãëóòàòèîíà, ìåðêàïòîýòàíîëà, öèñòåàìèíà, äèòèîòðåèòîëà è äð.):

HS ¾ CH2 ¾ ÑÍ2 ¾ NÍ  HS¾CH2¾CH(ÎÍ) ¾ ÑÍ (ÎÍ) ¾ ÑH2 ¾ SH

Öèñòåàìèí    Äèòèîòðåèòîë

Î÷åíü âàæíî ïîääåðæèâàòü íà âñåõ ýòàïàõ âûäåëåíèÿ ôåðìåíòîâ íèçêóþ òåìïåðàòóðó, òàê êàê íåêîòîðûå èç íèõ äàæå ïðè -80°Ñ òåðÿþò àêòèâíîñòü.

Äëÿ îöåíêè ãîìîãåííîñòè ôåðìåíòíîãî ïðåïàðàòà ïðèáåãàþò ê îáû÷íûì ìåòîäàì áåëêîâîé õèìèè. Ïåðåëîìíûì ìîìåíòîì â óñîâåðøåíñòâîâàíèè ìåòîäîâ ïîëó÷åíèÿ âûñîêîî÷èùåííûõ, ãîìîãåííûõ ïðåïàðàòîâ ôåðìåíòîâ áûëî îòêðûòèå ñïîñîáíîñòè èõ êðèñòàëëèçîâàòüñÿ, îñóùåñòâëåííîå âïåðâûå â 1906 ã. À. Ä. Ðîçåíôåëüäîì (èì áûëà ïîëó÷åíà â âèäå êðèñòàëëîâ îêñèäàçà èç êîðíåé ðåäüêè) è ïðèîáðåòøåå ñ 1926 ã. øèðîêóþ èçâåñòíîñòü ïîñëå ðàáîòû Ä. Ñàìíåðà ïî ïîëó÷åíèþ êðèñòàëëè÷åñêîé óðåàçû èç áîáîâ êàíàâàëèè. Íåðåäêî î ñòåïåíè ÷èñòîòû ôåðìåíòíîãî ïðåïàðàòà ñóäÿò ïî åãî áèîëîãè÷åñêîé àêòèâíîñòè; åñëè àêòèâíîñòü ïðè äàëüíåéøåé î÷èñòêå íå âîçðàñòàåò, ïðåïàðàò ìîæíî ñ÷èòàòü ãîìîãåííûì. Èç 2003 âêëþ÷åííûõ â ñïèñîê ôåðìåíòîâ áîëåå 1500 âûäåëåíî è â òîé èëè èíîé ìåðå î÷èùåíî, òðåòüÿ ÷àñòü èõ çàêðèñòàëëèçîâàíà, ó íåñêîëüêèõ ñîòåí âûÿñíåíà ïåðâè÷íàÿ, à ó íåñêîëüêèõ äåñÿòêîâ - òðåòè÷íàÿ ñòðóêòóðà.

Ëèòåðàòóðà

1. Âëàñîâà Ç.À. Áèîëîãèÿ. Ñïðàâî÷íèê øêîëüíèêà. Ì., Âñåðîññèéñêîå ñëîâî, 1995 ã.

2. Õîì÷åíêî Ã.Ë. Õèìèÿ äëÿ ïîñòóïàþùèõ â ÂÓÇû. Ó÷åáíîå ïîñîáèå. Ì., Âûñøàÿ øêîëà, 1993 ã.

3. Áèîëîãè÷åñêèé ýíöèêëîïåäè÷åñêèé ñëîâàðü. Ïîä ðåä. Ãèëÿðîâà Ì.Ñ. Ì., Ñîâåòñêàÿ ýíöèêëîïåäèÿ, 1987 ã.