Фосфатаза микробного происхождения

 

СОДЕРЖАНИЕ 
 
1. Характеристика препарата…………………………………………………2 
1.1. Показатели (нормы)……………………………………………………....3 
1.2. Катализируемая реакция………………………………………………....3 
1.3. Применение и назначение препарата…………………………………....3 
2. Технология получения препарата………………………………………....4 
2.1. Продуцент фермента……………………………………………..……....4 
2.2. Источники углерода……………………………………………………...4 
2.3. Источники азота……………………………………………………..…....4 
2.4. Способы культивирования ………………………………………………4 
2.5. Выделение…………………………………………………………………5 
2.6. Процессуально - технологическая схема………………………………..7 
Заключение…………………………………………………………………….10 
Список использованной литературы…………………………………………11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.Характеристика  препарата

Щелочная фосфатаза (англ. Alkaline phosphatase, ALP, ALKP) — фермент гидролаза (КФ 3.1.3.1), отщепляющая фосфат (дефосфорилирование) от многих типов молекул, например, нуклеотидов, белков и алкалоидов. Фермент проявляет наибольшую активность в щелочной среде. Она обнаружена в дрожжах, микроорганизмах, грибах, низших растения, в тканях млекопитающих, лимфе, плазме, лейкоцитах крови, молоке и т.д. В животных организмах этот фермент встречается почти во всех органах.

 Щелочная  фосфатаза бактерий относительно  устойчива к инактивации, денатурации  и деградации. Возможно, одной из  функций фосфатазы является отщепление  фосфатов от органических молекул,  так как многие фосфорилированные  соединения не могут проникать  через плазматическую мембрану.

Бактериальные щелочные фосфатазы могут быть локализованы в периплазме, связаны с мембраной или секретироваться в культуральную среду.

Щелочная  фосфатаза Escherichia coli представляет собой гомодимер с молекулярной массой 94кДа. Каждая субъединица состоит из 449 аминокислотных остатков и не содержит ни углеводной, ни липидной части. Щелочная фосфатаза является металлоферментом: каждая субъединица содержит два атома цинка и один атом магния.

Щелочная  фосфатаза Escherichia coli – типичный пример секретируемых белков. Биосинтез фермента происходит на полисомах, связанных с внутриклеточной мембраной, и по мере синтеза растущая полипептидная цепь фермента транслоцируется через мембрану в периплазматическое пространство. Определенная часть фермента прочно связана с мембраной и представляет собой мембраносвязанный предшественник периплазматической щелочной фосфатазы. Он имеет дополнительный N-концевой сигнальный пептид, который не вносит существенного вклада в каталитические свойства фермента и необходим, по-видимому, только для транслокации фермента через мембрану.

 

 

1.1. Показатели (нормы):

Внешний вид: прозрачный раствор при интенсивном  перемешивании пенится.

Активность: 30 ед/мг

Рабочая зона действия: рН 7.5-9.5

Безвредность  в тест-дозе:

Безопасен для животных и людей.

Гарантийный срок хранения:

1 год

Упаковка:

2x10 мл

1.2 Катализируемая  реакция

Одним из ферментов, использование которых  позволяет повысить эффективность  биосинтетического получения аналогов нуклеозидов, является щелочная фосфатаза E. coli.

1.3 Применение  и назначение препарата.

Щелочная  фосфатаза - фермент, катализирующий удаление 5'-концевой фосфатной группы из линейной ДНК или РНК при высоком  рН. Используется в генной инженерии  для дефосфорилирования ДНК перед  лигированием; получения конъюгатов с олигонуклеотидами для хемилюминесцентного  мечения генов в гибридизационной технике; в медицине для получения  иммуноконъюгатов; для получения  рекомбинантных диагностических антител  к клеточным рецепторам с целью  создания реперных белков для диагностики  и т.д.

 

 

 

 

 

 

2.Технология  получения препарата

2.1 Продуцент  фермента

Escherichia coli

Морфологические признаки. 
Клетки прямые, палочковидной формы, подвижные, неспоровые. 
Культуральные признаки. 
Клетки хорошо растут на глюкозоминеральной среде, содержащей в 1 л, грамм NаСl  4,68; КСl  1,49;NH4Cl  1,07;  MgSO4 0,1; СаСl 0,04, Na2SO4 0,099; . FeCl3 0,0022,  трис  6; глюкоза 10,  ортофосфат 1 мМ, тиамин 1 мг; пептон 0.08%.  При росте на жидких средах, в том числе на МПБ или LB-бульоне, образуют ровную интенсивную муть. При росте на мясо-пептонном агаре образуют округлые, гладкие с ровными краями, выпуклые, бесцветные колонии. 
Физиолого-биохимические признаки. 
Клетки растут при 37 С, оптимум рН 7, 5-7, 8, При росте в глюкозоминеральных средах требуют 20 мкг/мл метионина. 
Устойчивость к антибиотикам. 25 
Устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды рН 1-7 с ампициллиновым геном. Растет в присутствии 20 мкг/мл ампициллина.

2.2 Источники  углерода

В качестве источников углерода используют глюкозу, не усваивают лактозу.

2.3 Источники  азота

В качестве источников азота используется пептон.

Пептон  — препарат, полученный из молока и мяса животных под действием протеолитических ферментов.

2.4 Способы  культивирования

ПО1. Подготовка питательной среды.

Культивирование штамма проводят на жидкой глюкозо-минеральной среде содержащей в 1 л, грамм NаСl  4,68; КСl  1,49;NH4Cl  1,07;  MgSO4 0,1; СаСl 0,04, Na2SO4 0,099; . FeCl3 0,0022,  трис  6; глюкоза 10,  ортофосфат 1 мМ, тиамин 1 мг; пептон 0.08%,  с добавлением  20 мкг/мл ампициллина.

ПО2. Стерилизация

Среду стерилизуют автоклавированием (паровой метод) - обеспечивающий гибель в стерилизуемом материале вегетативных и споровых форм патогенных и непатогенных микроорганизмов, при 1 атмосфере 45 минут.

ТП1. Ферментация 

Проводится на качалке со скоростью 120 об/мин с аэрацией, при 37 С за 5 ч культура достигает экспоненциальной стадии роста. Затем культуру разбавляют в соотношении 1/20 свежей средой того же состава, но без ортофосфата и культивирование продолжают еще 15 ч. Через ч 4 инкубации достигается максимальная активность внутриклеточной щелочной фосфатазы 0, 07 Е/мг.

2.5. Выделение

ТП2. Центрифугирование

Бактериальные клетки осаждают на проточной центрифуге при 5000 g в течение 10 мин.

ТП 3. Гомогенизация

Суспензию клеток размельчают скальпелем. На 500 гр биомассы: заливают 2.5л 0, 01 М трис-НСl буфером рН 7, 5, содержащем 0, 01 MgCl2, помещают в ледяную баню. Содержимое стакана перемешивают до получения гомогенной суспензии.

ТП4.Дезинтеграция

Термошок проводят для дезинтеграции  клеток. Суспензию биомассы ставят в кипящую баню, постепенно заливают 2, 5 л кипящего 0,01 М трис-НС1 буфера, рН 7, 5содержащего 0, 01М МgСl2, с целью доведения температуры клеточной суспензии до 82+2ºC. 15 мин. После экстракт охлаждают до 4+2 ºС.

ТП5. Центрифугирование

Экстракт центрифугируют при 10000 g 1 час, супернатант используют для выделения фермента.

ТП6. Концентрирование

Модуль кассетный мембранный представляет собой прямоугольный блок размером 210х175 мм и толщиной 18 мм. Каждый модуль содержит пакет попарно параллельно расположенных мембранных фильтров, между которыми проходит дренажный сетчатый слой. Исходный поток жидкости проходит внутри дренажного слоя в узком зазоре между парами мембран. Дренажный слой вызывает турбулизацию фильтруемой жидкости. Турбулизация жидкости противодействуют концентрационной поляризации (намывание слоя фильтруемого продукта на поверхности мембраны) и усиливает эффект тангенциального направления потока, подаваемого на мембраны. 
Насадочную жидкость концентрируют ультрафильтрацией кассетным прибором “Реllcon” до 500 мл.

ТП 7 Фракционирование

Фракционирование  проводят высаливанием. При добавлении  растворов  солей  щелочных и щелочноземельных металлов  происходит осаждение белков  из раствора. Обычно белок не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей методами диализа или гельхроматографии.  Сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более эффективно при pH<pI.

 К концентрату при постоянном  перемешивании добавляют сухой сульфат аммония до 60% насыщения. Осадок отделяют и отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 85% насыщения.

ТП8. Центрифугирование

Осадок собирают центрифугированием 5000g  30мин.

ТП9. Выделение

Для отделения низкомолекулярных примесей или замены состава среды используют диализ. Метод основан на том, что молекулы белка из-за своих размеров не могут проходить через полупроницаемые мембраны, в то время как низкомолекулярные вещества равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором. После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке (концентрация солей, величина pH и др.) будет тот же, что и в окружающем растворе.

Осадок  растворяют в 150 мл 0,01 М трис-НСl буфера, рН 7.5, содержащего 0,001 М МgCl2, и диализируют в течение 18 ч против 10 л указанного буфера. Получают 180 мл диализата

ТП10.  Очистка

Разделение молекул методом хроматографии на колонках. В этом случае смесь молекул в растворе пропускают через колонку, содержащую твердый пористый матрикс. В результате взаимодействия с матриксом различные молекулы проходят через колонку с различной скоростью. После того как они достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями.

Диализат фермента (180 мл) подвергают хроматографии на колонке (5*25 см) с ДЭАЭ-целлюлозой ДЭ-52 (диэтиламиноэтилцеллюлоза), уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора, колонку промывают 1,5 л исходного буфера.

ТП11. Десорбция

 Элюирование - извлечение вещества вымыванием его подходящим растворителем – элюентом.

Элюируют линейным градиентом (Зл) NаСl от 0,1 до 0,5М в исходном буфере, собирая фракции по 10 мл. Щелочная фосфатаза элюируется в пределах 0,1 – 0,15M NаСl.

ТП12. Фракционирование

Объединенные активные фракции (150 мл) осаждают сульфатом аммония до 80% -ного насыщения.

ТП13. Центрифугирование

Центрифугирование проводят при 22000 g  в течении 15 мин.

ТП14. Выделение

Осадок растворяют в 40 мл 0,01М трис-НСl буфера, рН 7,5, содержащего 0,001М ZnCl2, и диализуют 18 ч против 2 л того же буфера. Получают 50 мл диализата.

ТП15.Повышение чистоты ферментного препарата 
Диализат щелочной фосфатазы (50мл) подвергают хроматографии на колонке (2,5* 15 см) с СL-сефарозой 6В краснокоричневый краситель 2К, содержащей 1,4 мкм красителя/мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером. 
При этом фосфатаза не сорбируется и выходит острым пиком, а нуклеазные примеси сорбируются и могут быть элюированы при повышении ионной силы до 1М КСl. Фракции щелочной фосфатазы объединяют и концентрируют.

ТП16. Концентрирование

Объединенные фракции диализуют против 1 л 0, 01 М трис-НСl буфера рН 7,5, содержащего 0,001М MgCl2, 0,05М NаСl и 50 глицерина (по объему). Диализ продолжают в течение 12ч.

УМО Упаковка

Препарат разливают в предварительно охлажденные ампулы по 10 мл и хранят при -20º С.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение.

Выход щелочной фосфатазы E.Coli , составляет ЗЗ% с удельной активностью 30 ед/мг белка. Ферментный препарат не содержит нуклеазных примесей и пригоден для использования в генно-инженерных экспериментах и молекулярной биологии. Активность щелочной фосфатазы E.Coli определяют по гидролизу 4-нитрофенил фосфата. За единицу активности принимают то количество фермента, которое гидролизует 1 мкм 4-нитрофенилфосфата за 1 мин при 25ºС. В полученном препарате отсутствуют дезоксинуклеазные, дезоксиэкзонуклеазные и рибонуклеазные примеси.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список  использованных источников:

1. Грачева И.М. «Технология ферментных препаратов». М.: Агропромиздат, 2004. 335с.
2. Микробные ферменты и биотехнология. / Под ред. В.М. Фогарти. / пер. англ. Под ред. И. М. Грачевой – М.: Агропромиздат, 1986. – 320 с.
3. http://earthpapers.net
4. http://www.dissercat.com
5. http://ru.wikipedia.org
6. http://www.ibch.ru
7. http://patentdb.su

 

 

 

 

 

 

 

 

 

					Д250.101.21.22.0000ПЗ	Лист
Изм.	Лист	№ документа	Подпись	Дата

 

					Д250.101.21.22.0000ПЗ	Лист
Изм.	Лист	№ документа	Подпись	Дата