Альтернативные методы исследования в ветеринарной медицине

3. Использование ионизирующих излучений для диагностики болезней и лечения животных.

Радионуклиды и ионизирующие излучения для диагностических и лечебных целей успешно и широко применяются в медицине. В ветеринарии эти способы пока еще малодоступны для практического использования, хотя и имеется ряд разработок, показывающих высокую их эффективность и перспективность. Лечебное применение радиоизотопов и излучений основано на их биологическом действии. Поскольку наиболее радиопоражаемы молодые, энергично размножающиеся клетки, то радиотерапия оказалась эффективна при злокачественных новообразованиях. Как показали исследования и клинические наблюдения, нейтроны и другие плотноионизирующие частицы более эффективны в радиотерапии опухолей, так как они действуют одинаково как на гипоксические, так и оксигенированные опухолевые клетки. Кроме того, при действии нейтронов отсутствуют различия в радиочувствительности клеток на разных фазах клеточного цикла, что является преимуществом этого вида воздействия с точки зрения эффективности лучевой терапии. Но главным преимуществом нейтронов является их высокая биохимическая эффективность по отношению к гипоксическим клеткам, повышающая надежность лучевой терапии вследствие более радикального уничтожения опухолевых клеток. Все сказанное свидетельствует о перспективности использования нейтронов наряду с другими тяжелыми заряженными частицами для лечения опухолей. Проводятся широкие клинические исследования с источниками нейтронного излучения калифорния-252, который более доступен, а главное менее дорогостоящий для практического использования в сравнении с ускорительными и реакторными установками. При этом при небольших размерах источника можно получать мощность дозы нейтронного потока, соответствующую требованиям имплантационной и аппликационной терапии. Перспективен, но пока еще мало разработан метод лечения опухолей нейтронами (нейтронзахватная терапия), позволяющей «обстрелять» опухоль изнутри α-частицами. Сущность его состоит в создании альфа-источника в толще самой опухоли. Для этого предварительно в организм вводят тумотропный нейтрон - захватывающий агент в виде стабильного изотопа бора-10 или лития-6. Затем подвергают опухоль многопольному нейтронному облучению. Указанные изотопы, захватив нейтроны, приобретают радиоактивные свойства, испускают α-частицы. Обладая большой плотностью ионизации, но коротким пробегом (не более 15 мкм), α-частицы не вылетают за пределы опухолевых клеток, воздействуют на них, не повреждая окружающие здоровые ткани. Достоинство метода заключается еще в том, что альфа-излучение можно дозировать, так как оно прекращается одновременно с прекращением нейтронного облучения [11, 14] .

4. Специальные методы исследования крови

К специальным методам  исследования крови прибегают в  тех случаях, когда необходимо и  возможно установить диагноз на уровне изучения морфологических характеристик  клеток в мазке или изменения  их функциональных свойств под воздействием различных факторов. В первом случае исследования ведут с использованием цитохимических красителей, специфически реагирующих с определенными  включениями или компонентами клеток; функциональные свойства клетки определяют как ответ на физико-химические воздействия [15].

Эритроциты. Для выявления  характера анемии прибегают к  исследованиям клеток на резистентность и специальным цитохимическим исследованиям. Резистентность (или устойчивость) эритроцитов значительно снижается при некоторых гемолитических анемиях, обусловленных дефектом эритроцитов. Наиболее распространено в клинике исследование осмотической резистентности эритроцитов, основанное на определении максимальной и минимальной степени гемолиза эритроцитов при инкубации их в растворе с различной концентрацией хлорида натрия. При снижении резистентности эритроцитов появление гемолиза наступает при более высокой концентрации соли (0,6-0,7% раствор и даже 0,8%). Резкое снижение устойчивости мембран эритроцитов наблюдается при микросфероцитозе, а повышенное - в случае талассемии.

Исследование механической резистентности основано на определении  в плазме гемоглобина после обработки  крови в аппарате для встряхивания. В норме после этого воздействия  в плазме обнаруживают 15-30 г/л гемоглобина, снижение механической устойчивости сопровождается образованием большого количества гемоглобина  и характерно для ряда приобретенных  форм гемолитических анемий. Кислотная резистентность определяется на основании различной кислотоустойчивости эритроцитов, определяемой по времени наступления гемолиза. При графическом выражении кривая кислотоустойчивости имеет треугольную форму, начало гемолиза отмечается на 3-й минуте, максимум приходится на 4-5-ю минуту, а полный гемолиз наблюдается через 8-10 минут. Гемолитические анемии и связанные с ними гиперретикулоцитоз наследственный микросфероцитоз сопровождаются повышенной кислотоустойчивостью эритроцитов, при некоторых формах несфероцитарных гемолитических анемий кислотоустойчивость нормальная. Цитохимические исследования эритроцитов проводят в мазках крови с использованием специфической химической реакции для определения различных веществ. Относительная простота, быстрота выполнения и доступное оборудование дают преимущество этим полуколичественным методам, значительно уступающим биохимическим методам определения.

Внутриклеточное железо определяют с помощью специфической реакции  на берлинскую лазурь, позволяющей  обнаружить в эритроцитах гранулы  железа (сидероциты). Уменьшение числа  сидероцитов наблюдается при  железодефицитных анемиях, увеличение - при гемолитических анемиях, особенно в период криза. Внутриэритроцитарные включения выявляют путем денатурации гемоглобина под влиянием окисляющих веществ (бриллиантовый крезиловый синий и др.) с образованием в клетках мелких круглых гранул синего цвета. Появление их в эритроцитах свидетельствует о неустойчивости гемоглобина к окислению.Тельца Гейнца определяют с помощью неокисляющих красителей (метиловый фиолетовый и др.). В эритроцитах выявляются одиночные круглые крупные гранулы фиолетового или синего цвета. Появление их в эритроцитах, как и внутриэритроцитарных включений, свидетельствует о наличии патологически нестабильных форм гемоглобина, дефиците ферментов и других формах гемолитической анемии.

Фетальный гемоглобин эритроцитов  определяют цитохимически на основе его большой кислотоустойчивости  по сравнению с гемоглобином взрослых животных. У здоровых новорожденных  в крови преобладают эритроциты, содержащие фетальный гемоглобин (окрашенные эритроциты после кислотного воздействия). У взрослых животных такие окрашенные эритроциты в мазках встречаются  в единичных случаях. Увеличение эритроцитов с фатальным гемоглобином отличаются при тассемии, различных анемиях, заболеваниях легких, сердечно-сосудистой системы, гемобластозах, некоторых острых инфекциях. Активность фермента глюкозо - 6 - фосфат дегидрогеназы (Г-6-ФД) в эритроцитах определяют по наличию гранул формазана - продукта реакции нитросинего тетразолия и НАДФ H 2 . При нормальной активности Г-6-ФД в эритроцитах образуется 10-20 гранул формазана. Уменьшение их числа является признаком ферментодефицитной (Г-6-ФД) гемолитической анемии. Лейкоциты. Цитохимическое исследование используется дм выявления функциональных изменений свойств клеток, изучения процессов внутриклеточного метаболизма к особенностей распределения различных веществ в клетках [16].

5. Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением

Сойни и Койола описали  простой флуориметр с ручным управлением, специально созданный для флуоресцентного  иммуноанализа с применением  хелатов лантанидов. Недавно разработан новый высокочувствительный флуориметр с разрешением во времени Arcus 1230, предназначенный для определения  европия. Широкий динамический диапазон этого прибора обеспечивает создание таких методов иммунометрического анализа, которые отличаются не только высокой чувствительностью, но и очень широким диапазоном определяемых концентраций. На этом приборе можно проводить определение хорионического гонадотропина человека в концентрациях от 0,1 до 1000 м. ед. /л. Прибор пригоден для проведения измерений как в пробирках, так и в лунках стрипов.

Подготовка проб и выполнение анализа. Использование стрипов  позволяет повысить эффективность  работы оператора и увеличить  число анализируемых проб. Подготовку проб и выполнение анализа облегчает  применение приспособлений для добавления реагентов, встряхивания микропланшетов, автоматической или ручной промывки лунок. Гибкая система математической обработки данных флуориметра Arcus позволяет  представлять результаты измерений  в нескольких вариантах. Флуориметр пригоден для работы как с серийно  выпускаемыми наборами, так и с  оригинальными методиками. Обезвреживание отходов. Все компоненты флуоресцентного иммуноанализа сравнительно безвредны, и их легко можно захоронить.

  Альтернативный метод определения гаптенов.

Меченый антиген. Ловгреи  описал конкурентный метод определения  прогестерона в периферической плазме с помощью нового конъюгата прогестерон-EDTA-Eu. В этом методе используется строго ограниченное количество иммобилизованных на твердой фазе антител, полученных к конъюгату 11а-сукцинил-про-гестерона  с БСА.

Меченые антитела. Предложено несколько подходов к разработке иммунометрических методов определения  гаптенов [17].

На рис.8 представлена схема  одного из них, включающего несколько  стадий неравновесных односайтовых анализов. В соответствующей методике применены моноклональные антитела, меченные аминофенил-EDTA-Eu, и избыток  конъюгата 11-сукцинил-прогестерона с  тироглобулином быка, иммобилизованного  на поверхности пластиковых вкладышей. Вкладыши помещают в лунки стрипов  микротитровальных планшетов. Метку  измеряют в "свободной" фракции  антигена на вкладыше после промывки и удаления остатков биологических  образцов. В предварительных экспериментах  достигнуты большая чувствительность и лучшая точность, чем в конкурентных методах иммуноанализа.

Радиоактивные маркеры сыграли  большую роль в разработке различных  методов иммуноанализа для определения  самых разнообразных соединений. Однако можно ожидать, что наметившаяся тенденция разработки люминесцентных методов иммуноанализа без радиоактивных  меток будет развиваться и  в будущем. Действительно, чувствительность определения ионов европия очень  высока, а удельная активность меченных европием конъюгатов может превышать  активность конъюгатов, меченных радиоизотопами. Следовательно, метод DELFIA может обладать большей чувствительностью, чем  метод ИРМА. Применяемые в DELFIA реагенты сравнительно безопасны и легко  поддаются захоронению. Меченые  вещества очень устойчивы и не теряют активности в течение по меньшей  мере 1 года. Метод DELFIA успешно применен для разработки двухсайтовых иммунометричёских  анализов белков и прямых конкурентных анализов гаптенов. Можно надеяться, что введение новых флуоресцентных меток и соответствующих приборов будет способствовать разработке методик, которые можно будет выполнять в палатах больниц, поликлиниках и иа дому. Биохимические и физиологические исследования требуют еще большего повышения чувствительности, и здесь может оказаться очень существенным развитие люминесцентного иммуноанализа [18].

В настоящее время иммуноанализ только начинают применять в ветеринарии, однако успехи иммунодиагностики человека являются надежным базисом для развития и этой области. Сейчас разрабатываются новые методы иммуноанализа; можно надеяться что люминесцентные системы определения в конце концов вытеснят более обычные в настоящее время методы радиоиммуноанализа и иммунорадиометрического анализа. В настоящий момент основные усилия направлены на разработку быстрых методов анализа, позволяющих поставить диагноз на месте пробы. Ясно, что иммуноферментный анализ и иммуноанализ на частицах лучше отвечает этим целям, так как они позволяют интерпретировать результате визуально. В этой связи понятно, почему сейчас поступает в продажу большое число наборов, в которых используются методу ИФА и латексной агглютинации. Здесь оказываются полезными же технические новшества, что и в диагностике заболеваний человека, когда требуются быстрые и дешевые тесты для контражизненноважных ситуаций и лечения. Существуют три основные сферы применения иммунодиагностики на базе ИФА и агглютинации в ветеринарии: 1) оценка фертильности; 2) диагностика инфекционных заболеваний; 3) обнаружение токсинов и остаточных количеств различных веществ. Иммунодиагностика приобретает большое значение и в других сферах ветеринарии, перечисленных в табл. 1. Преимущества иммунодиагностики и наиболее интересные методики будут рассмотрены ниже. Развитие иммунодиагностики в ветеринарии обусловлено рядом причин: 1) ростом рынка сбыта соответствующих наборов; 2) немногочисленностью правовых барьеров; 3) простоте; и доступностью методик [19].

Основными потребителями  иммунодиагностических наборов  будут, очевидно, специализированные лаборатории, ветеринарии лечебницы и владельцы  скота; в последнем случае анализы  будут выполнять сам фермер или  ветеринар непосредственно на месте  содержания животных. Очевидно, что  методика анализа определяется предполагаемым потребителем. Например, набор для  анализа в полевых условиях должен быть полностью укомплектован готовыми к применению реагентами; еще важнее, чтобы методика была простой и  непродолжительной по времени выполнения. Стоимость каждого полевого набора будет зависеть от спроса, и понятно, что наборы для анализов в полевых  условиях будут относительно недорогими. Напротив, цена наборов для немногочисленных лабораторных анализов будет более  высокой. Место выполнения анализа  определяет и максимальное время  его выполнения. Так, лабораторные анализы  могут выполняться в течение  нескольких часов, а идеальный анализ в полевых условиях должен отнимать несколько минут. Оценка фертильности. В ветеринарии внимание фирм, производящих иммунодиагностические наборы, и академических исследователей прежде всего привлекла диагностика фертильности или фекундильности. Хотя это и не столь очевидно, отсутствие контроля фертильности крупного рогатого скота может нанести фермеру большой экономический ущерб. Следовательно, быстрая и надежная оценка фертильности животных должна дать значительный экономический эффект. В настоящее время наиболее полезными показателями репродуктивного статуса являются изменения концентраций различных гормонов или их метаболитов. Внедрение методик иммуноанализа способствовало дальнейшему развитии диагностической микробиологии. Иммуноанализ имеет ряд преимуществ перед традиционными методами анализа, такими, как гемагглютинация, ингибирование гемагглютинации, нейтрализация, фиксация комплемента, иммунное слипание и изучение тканевых культур. В частности, в диагностике инфекционных заболеваний в ветеринарии широкое распространение получил иммуноферментный анализ; использовались также радиоиммуноанализ и, позднее, метод латексной агглютинации. До недавнего времени эта область диагностики была менее развита; по сути дела, в ветеринарию переносили методики, разработанные для диагноза инфекций человека. Примером может служить определение ротавируса – одного из агентов, вызывающих воспаление тонкой кишки. Действительно, методики ИФА и латексной агглютинации, предназначенные для определения ротавирусной инфекции у человека, в настоящее время используются и в ветеринарной диагностике. В отличие от. наборов для оценки фертильности, с которыми работает сам фермер, диагностика инфекционных болезней будет, вероятно, выполняться в центральной лаборатории или ветеринарной лечебнице. Наиболее распространенные инфекционные заболевания, для диагностики которых выпускаются иммунодиагностические наборы, перечислены в табл. 1. Для обнаружения вирусных или бактериальных антигенов традиционно используют двухсайтовые методы ИФА типа ELISA, тогда как для определения уровня циркулирующих антител против компонентов инфекционных агентов применяют непрямые методы ИФА типа ELISA. Схематически двухсайтовый и непрямой методы ИФА типа ELISA представлены на рис. 4а и 4б. В последнее время по экономическим соображениям стали отказываться от методов ИФА на микротитровальных планшетах. Примером может служить новый и более удобный для потребителя набор Immunpcomb System, разработанный и выпускаемый фирмой Orgenics и основанный на непрямом методе ИФА типа ELISA.