Диагностика чумы крупного рогатого скота

ной культуре проводят идентификацию выделенного возбудителя, в РН,

МФА и ИФА, а также методами ЭМ и ИЭМ.

 

3.8. Постановка биопробы

Постановку биопробы.проводят на двух неиммунных и двух иммун-

ных против чумы КРС телятах 8-12-месячного возраста.

Иммунных телят используют в опыте не ранее, чем через 2 нед

после иммунизации их вакциной из штамма К37 70.

 

Для заражения животных используют поступивший из очага инфек-

ции патологический материал, приготовленный по пункту 2.7. Каждому

теленку вводят внутривенно по 3-5 куб.см гепаринизированной крови

и подкожно по 5-10 куб.см 10-20% осветленной центрифугированием сус-

пензии, содержащей смесь лимфатических узлов, селезенки и слизис-

той сычуга в равных объемах. Кровь и органо-тканевую суспензию

предварительно обрабатывают антибиотиками (1000 Ед пенициллина и

1000 мкг стрептомицина на 1 куб.см).

 

За животными ведут клиническое наблюдение с ежедневной термо-

метрией в течение 21 дня.

 

При наличии вируса чумы КРС в исследуемом патматериале неим-

мунные телята заболевают с проявлением типичных клинических приз-

наков, характерных для чумы КРС. Иммунные животные должны оставать-

ся клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.

 

Для подтверждения специфичности заболевания, выделения и

идентификации возбудителя болезни от больных телят на пике темпе-

ратурной реакции берут кровь, а в период максимального проявления

клинических признаков болезни (на 3-4сут гипертермии) проводят

частичную экстирпацию предлопаточного лимфатического узла либо

диагностический убой больного животного с последущим взятием

патматериала для исследования  в серологических реакциях (РCК, РДП,

ИФА, МФА).

 

От незаболевших животных исследуют парные сыворотки, взятые

до заражения и через 2-3 недели после инфицирования, для опреде-

ления. уровня антител в РН и РСК.

 

Основанием для  постановки диагноза является заболевание

неиммунных животных с характерными для чумы КРС клиническими приз-

наками и последующее подтверждение специфичности (обнаружение

антигена) болезни в серологических реакциях. При этом иммунные

животные должны оставаться здоровыми в течение всего опыта.

 

3.9. Электронная и иммуноэлектронная  микроскопия.

3.9.1. Общая схема приготовления  препаратов для электронной

(ЭМ) и иммуноэлектронной (ИЭМ) микроскопии  включает следующие

этапы:

-органо-тканевые вируссодержащие материалы (лимфатические

узлы, селезенка, слизистая сычуга и кишечника) гомогенизируют

в физрастворе в соотношении 1:5. Гомогенат разбавляют тремя, объема-

ми 0,05 М ФБР, рН 7,0 и осветляют центрифугированием при 2500 об/м

в течение 10-15 мин;

 

-культуральную вируссодержащую жидкость центрифугируют при

500 об/мин, в течение 10-15 минут; полученный  осадок клеток гомо-

генизируют, ресуспендируют в 0,05 М ФБР и осветляют при том же

режиме центрифугирования. Надосадочные жидкости объединяют.

 

3.9.2. В зависимости от поставленной задачи очистку и кон-

центрирование вируса из полученных осветленных виру с содержащих

суспензий проводят по одной из следующих схем:

- надосадочную вируссодержащую  жидкость центрифугируют при

25000 об/мин. (40000-50000 ) в течение 40-60 мин. Осадок ис-

пользуют для  исследований или ресуспендируют в 5 см3 0,05 М ФБР,

рН 7,0 и центрифугируют при том же режиме через 0,5 куб.см 30%  раст-

вора сахарозы. Полученный осадок ресуспендируют в 0,1 куб.см 0,05 М

ФБР и используют для исследований, либо растворяют в  5 см  ФБР

и переосаждают при 25000 об/мин в течение 30 мин. Осадок после

ресуспендирования используют для приготовления, препаратов для ЭМ

и ИЭМ;

в надосадочную вируссодержащую жидкость вносят ПЭГ-6000

до концентрации 6-8% (можно использовать сульфат бария или сульфат

аммония в концентрации 2%, через 4-6 ч образовавшийся осадок

отделяют центрифугированием при 2500 об/мин, в течение 10-15 мин,

растворяют в 0,05 М ФБР (рН 7,0) в соотношении 1:100, наслаивают

на градиент 20-60% сахарозы и центрифугируют при 50000  в течение

40-60 мин.  Полосу, содержащую вирус, разводят в 5 см  0,05 М ФБР

и переосаждают при 25000 об/мин  в течение 30 мин. Полученный

осадок ресуспендируют в минимальном объеме дистиллированной воды

и используют для исследований.

 

3.9.3. Прямая электронная микроскопия  с использованием

метода негативного контрастирования

Каплю вируссодержащего материала (~100 мкл) вносят в лунку

тефлоновой пластины.

 

На каплю на 10 мин   помещают сетку с формваровой подложкой,

напыленной углем.

 

После адсорбции сетку 1-2 мин. промывают на капле дистилли-

рованной воды и контрастируют 5 мин на капле 2%-ного раствора

фосфорно-вольфрамовой кислоты, рН 6,8.

 

Избыток контрастера с сетки убирают фильтровальной бумагой

и после просушивания исследуют в электронном микроскопе.

 

3.9.3.1. Учет результатов

При оценке результатов используют морфологию и размер вирус-

ных частиц и структурных компонентов, тип симметрии нуклеокапсида,

характерные для  парамиксовирусов.

 

3.9.4. Иммуноэлектронная микроскопия

Для  проведения, иммунной реакции используют специфические сы-

воротки или иимуноглобулины с высокой специфической активностью.

В вируссодержащую надосадочную жидкость,  полученную после

осветления  низкоскоростным  центрифугированием (см.п.3.9.1), вносят

специфическую сыворотку или иммуноглобулины в разведении 1:50-1:100

смесь инкубируют в течение 1-2 ч при (37±1)°С и образовавшийся

комплекс вирус-антитело осаждают центрифугированием при 1000g

в течение 60 мин  (в отдельных случаях для осаждения комплекса

можно использовать ПЭГ-6000 в концентрации 6-8% с последующим цен-

трифугированием в том же режиме).

 

Осадок ресуспендируют в минимальном объеме 0,05 М ФБР, рН 7,0

и используют для электронной микроскопии.

 

При использовании вируссодержащего материала, полученного при

улътрацентрифугировании или градиентном центрифугировании надоса-

дочной жидкости (см.п.3.9.2), 100 мкл исследуемого материала сме-

шивают с равным объемом специфической сыворотки или иммуноглобулина

(в разведении 1:50-1:100) и инкубируют 1-2 часа при (37±1)°С.

 

В первом и во втором случаях каплю смеси вирус-антитело вно-

сят в лунку тефлоновой пластинки, на поверхности капли помещают

сетку с формваровой подложкой, напыленной углем. Адсорбцию прово-

дят в течение 10 мин   при комнатной температуре. Промывку сетки

с материалом проводят на нескольких каплях дистиллированной воды

в течение 3-6 мин.

 

Контрастирование материала осуществляют в течение 5 мин

на капле 2%-ного раствора фосфорно - вольфрамовой кислоты, рН 6,8.

Избыток контрастера с сетки убирают фильтровальной бумагой, подсу-

шивают и просматривают в электронном микроскопе.

 

Контролем в опытах служат те же вирусодержащие препараты,

подготовленные аналогичным образом, с использованием нормальной

сыворотки или гаммаглобулина. Для предотвращения неспецифической

агрегации вирионов в рабочий раствор в том и другом случаях до-

бавляют 0,025 М раствор ЭДТА (1-5 мкл на 1000 мкл суспензии).

 

3.9.5. Учет результатов

 

При оценке результатов учитывают как морфологию и структуру

вируса, так и образование комплексов вирусных частиц со специфи-

ческими антителами (образование мостиков из антител между вирионами

опушение отдельных вирусных частиц и нуклеокапсида).

 

4. Правила ветеринарно-санитарного  режима при исследовании

проб на чуму КРС

 

4.1. При подозрении на чуму крупного рогатого скота взятие

и доставку, учет прихода, расхода и хранения, патматериала проводят

согласно действующей инструкции "О порядке хранения, обращения,

отпуска, а также вывоза и ввоза в СССР из зарубежных стран культур

микрорганизмов, токсинов и ядов животного и растительного происхож-

дения", утвержденной Главным управлением ветеринарии МСХ СССР

10.01.I974 г.

 

4.2. Всю работу по подготовке  проб и постановке серологических

  реакций проводят в специально  оборудованных боксовых помещениях:

с соблюдением правил, исключающих вынос инфекции.

 

Каждый бокс должен быть оборудован стерилизующей вытяжной

вентиляцией, УФ-лампами и противопожарными средствами. В боксе

необходимо иметь 2-3 комплекта спецодежды (халат, колпак, тапочки)

маски из 4 слоев марли, раствор для дезинсекции рук (2% р-р хлор-

амина или 70° этиловый спирт) и дезраствор на случай аварийной

ситуации при работе с вируссодержащим материалом (раствор гипохло-

рита натрия, или кальция с содержанием 1-2% активного хлора). Все

работы в боксе проводятся над пламенем горелки с соблюдением правил

противопожарной безопасности.

 

При работе с пипетками необходимо пользоваться резиновыми

грушами или другими приспособлениями, пипетирование вирусодержа-

щего материала ртом категорически запрещается.

 

Пробирки, ампулы, флаконы и другая посуда, используемые в

работе, должны иметь этикетки или четкие надписи с указанием наиме

нования материала, штамма и других характеристик.

 

4.3. По окончании работы остатки  материала, стеклопосуду и

инструменты погружают в 3% р-р щелочи или раствор гипохлорита натрия

на 2-3 ч , после чего посуду и инструменты кипятят в течение

30 мин , а отходы сливают в  специальную канализацию, имеющую  ло-

кальные колодцы для обеззараживания отходов.

 

Микропанели обеззараживают путем погружения в 70° спирт или

в 6% раствор перекиси водорода на 1 ч .

 

Рабочие столы  фламбируют спиртом, спецодежду (халаты, колпа-

ки и др.) обезвреживают путем автоклавирования при 0,15 МПа в те-

чение 2 часов. Боксовые помещения, облучают бактерицидными лампами

в течение 1-2 ч.

 

Персонал, работающий с вируссодержащим материалом, по оконча-

нии работы должен обработать руки хлорамином или спиртом и принять

сангигиенический душ.

 

4.4. В случае аварии во время, работы с вируссодержащим мате-

риалом сотрудники обязаны поставить в известность  руководителя

лаборатории и приступить к обеззараживанию инфицированных поверх-

ностей и места аварии гипохлоритом натрия или кальция. Инфициро-

ванные предметы (одежда, посуда, инструменты, боксы) обеззаражи-

вавтся , как указано в пункте 4.3.

 

При возникновении пожара вирулентный материал и холодильник,

где он хранится, выносу не подлежат.

 

Приложение 1

 

СПЕЦИФИКАЦИЯ

сырья, оборудования и диагностических препаратов,

применяемых при постановке серологических реакций

Техническое, фармацевтическое или торговое название	ГОСТ, ТУ, фармакопейная статья
1	2
Вода дистиллированная	ГОСТ 6709-72. Тенические условия
Перекись водорода (H2O2)	ГОСТ 10929-76
Ацетон	ГОСТ 2603-79
Нефлуоресцирующее иммерсионное масло	импорт (Серва)
Твин-80-20	импорт (Серва)
Агар	импорт (Дифко)
Риванол	импорт (Дифко)
ПЭГ-6000	импорт (Серва)
Гепарин	Любой марки
Гипохлорит натрия	ТУ-6-01-1274-82
Сульфат бария	ГОСТ 3158-75
Сульфат аммония	ГОСТ 10873-73
Сахароза	импорт (Серва)
Натрий углекислый кислый	ГОСТ 4201-79 Технические условия
Натрий углекислый	ГОСТ 83-79 Технические условия
Натрий хлористый	ГОСТ 4233-77. Технические условия.
Натрий фосфорнокислый однозамещенный	ГОСТ 245-76. Технические условия
Натрий фосфорнокислый двузамещенный	ГОСТ 4172-76. Технические условия.
Ортодианизидин	ТУ 6-09-07-707-76
Сыворотка крови крупного рогатого скота	ТУ 46-2I-9I6-73
Комплемент сухой для РСК	ГОСТ 16446-78. Технические условия
Сыворотка гемолитическая для РСК	ГОСТ 16445-78. Технические условия.
Спирт этиловый	ГОСТ 5962-67. Технические условия
Планшет для ИФА	ТУ 64-2-375-86
Посуда мерная, лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки	ГОСТ I770-74E. Технические условия
Весы равноплечные ручные	ТУ 64-1-2834-80
Термостат с регулируемой температурой нагрева	Зу-1125, Медлабтехника
Холодильник бытовой	любой марки
Центрифуга низкоскоростная	Бекман В-6В
Центрифуга высокоскоростная	Бекман Л-5-65В
Микроскоп световой	МБИ-6, ЛОМО
Микроскоп люминесцентный	Люмам И-3, ЛОМО
Мультискан	Лабсистемс, Финляндия
Антигены и сыворотки для постановки серологических реакций	ТУ 46-20-1I25-84
Эритроцитарный диагностикум	ТУ 46-20-II26-84
Сыворотка специфическая для МФА	ТУ 46-20-II23-84

Приложение 2

 

НАСТАВЛЕНИЕ

по комплектации и использованию набора-укладки

инструментов и материалов, необходимых для отбора

и доставки в лабораторию проб патологического ма-

териала при подозрении на чуму крупного рогатого

скота

 

1.Комплектация набора-укладки

 

1.1.Набор-укладка предназначен для  проведения патологоанатоми-

ческого вскрытия, павших и  убитых с диагностичес-

кой целью больных животных, отбора, упаковки и пересылка в лабора-

торию для исследования, проб патологического материала при подозре-

нии на чуму крупного рогатого скота (чуму КРС).

 

1.2. В комплект набора-укладки  входят следующие инструменты

и материалы:

 

1.2.1. Патологоанатомический набор  инструментов, включающий:

- секционные ножи - 2 шт.

- скальпели - 2 шт.

- ножницы кишечные - 1 шт.

- пинцеты различной величины  и назначения - 2 шт.

- очки из обыкновенного стекла - 2 шт.

- перчатки анатомические - 3 пары.

 

1.2.2. Прибор для взятия крови (пробирка+игла) - 30 шт.

1.2.3. Флаконы пенициллиновые с  резиновой пробкой стерильные

30 шт.

 

1.2.4. Пробирки бактериологические  с резиновой пробкой

стерильные - 30 шт.

 

1.2.5. Пакеты полиэтиленовые размером:  10х15 см - 30 шт.

20х39 см - 10 шт.

 

1.2.6. Гепарин - 1 фл. (5 куб.см).

 

1.2.7. Вата гигроскопическая. - 100 г

 

1.2.8. Бинт марлевый - 2 шт.

 

1.2.9. Лейкопластырь - 1 уп.

 

1.2.10. Шпагат - 10 м.

 

1.2.11. Карандаш (ручка) - 1 шт.

 

1.2.12. Стеклограф - 1 шт.

 

1.2.13. Бумага писчая - 10 листов

 

1.2.14.Раствор хлорамина с содержанием 2-3% активного

хлора - 0,5 л

 

1.2.15. Термоконтейнер или термос  на 2 л с широким горлом -

1 шт.

 

1.2.16. Комплект одежды - 1

 

1.2.17. Наставление по использованию  набора-укладки - 1

 

1.2.18. Чемодан-укладка - 1.

 

2. Патологоанатомическое вскрытие  павших и

убитых животных

 

2.1. При подозрении на чуму  КРС ветеринарные специалисты

обязаны руководствоваться "Инструкцией о мероприятиях по предупреж-

дению и ликвидации чумы крупного рогатого скота", утвержденной

Главным управлением ветеринарии.

 

Патологоанатомическое вскрытие  павших и

убитых с диагностической целью больных животных проводят ветеринар-

ный врач с помощником (ветеринарный фельдшер или санитар) при стро-

гом соблюдении требований Ветеринарного устава, законодательства

и соответствующих положений, утвержденных Главным управлением ве-

теринарии Минсельхоза России. Они же проводят отбор и упаковку

проб патологоанатомического материала, организуют и контролируют

порядок проведения, санитарной утильзацни трупов. При этом должны