Исследование физико-химических свойств крови

 Известны три главных  пути поддержания рН на постоянном  уровне: 1 — буферные системы жидкой  внутренней среды организма и  тканей; 2 — выделение СO2 легкими; 3 — выделение кислых или удержание  щелочных продуктов почками. В крови существуют следующие буферные системы: карбонатная, фосфатная, белков плазмы крови, гемоглобиновая.

 

Плотность. Плотность крови колеблется в узких пределах и зависит в основном от содержания в ней форменных элементов, белков и липидов. Плотность крови составляет у рыб 1,035 г/мл, у птиц — 1,052, у грызунов 1,051, у человека 1,060−1,064 г/мл. Плотность лейкоцитов и кровяных пластинок ниже, чем 131эритроцитов. При отстаивании в пробирке или центрифугировании несвернувшейся крови сверху располагается слой желтоватой жидкости, представляющий собой плазму, под ним находится тонкий беловатый пояс — лейкоциты и кровяные пластинки, наконец, внизу толстый слой (40-45 % объема) — эритроциты. Вязкость — еще один физический показатель крови. Она в 3−6 раз больше вязкости воды и находится в прямой зависимости от содержания в крови эритроцитов и белков. Вязкость возрастает при сгущении крови, наблюдаемом, например, при обильном потении.

 

 Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ)

Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) - неспецифический лабораторный показатель крови, отражающий соотношение  фракций белков плазмы; изменение  СОЭ может служить косвенным  признаком текущего воспалительного  или иного патологического процесса. Проба основывается на способности  эритроцитов в лишенной возможности  свёртывания крови оседать под  действием гравитации. В норме  величина СОЭ у собак не превышает 2-5 мм/час, а у кошек - 6-10 мм/час.

Принцип метода заключается  в следующем. Удельная масса эритроцитов  превышает удельную массу плазмы, поэтому они медленно оседают  на дно пробирки. Скорость, с которой  происходит оседание эритроцитов, в  основном определяется степенью их агрегации, то есть их способностью слипаться  вместе. Из-за того, что при образовании  агрегатов уменьшается отношение площади поверхности частиц к их объёму, сопротивление агрегатов эритроцитов трению оказывается меньше, чем суммарное сопротивление отдельных эритроцитов, поэтому скорость их оседания увеличивается. Агрегация эритроцитов главным образом зависит от их электрических свойств и белкового состава плазмы крови. В норме эритроциты несут отрицательный заряд и отталкиваются друг от друга. Степень агрегации (а значит и СОЭ) повышается при увеличении концентрации в плазме так называемых белков острой фазы - маркеров воспалительного процесса. В первую очередь - фибриногена, C-реактивного белка, церулоплазмина, иммуноглобулинов и других. Напротив, СОЭ снижается при увеличении концентрации альбуминов.

Определение СОЭ проводят методом Панченкова (в капилляре). В методе Панченкова в качестве антикоагулянта используют цитрат натрия. В капилляр набирают 2,5 мкл цитрата и в тот же капилляр добирают 7,5 мкл крови или в заранее раскапаные пробирки с цитратом добавляют 7,5 мкл крови, кровь с цитратом перемешивают в пробирке, снова набирают в капилляр и устанавливают в специальный штатив на 1 час. По методу Вестергрена (в пробирке).

В градуированный на 100 делений  капилляр Панченкова набирают до метки «Р» 5%-ый раствор цитрата натрия и переносят его на часовое стекло. Затем в тот же капилляр набирают дважды кровь до метки «К» и оба раза выдувают её на часовое стекло. Кровь, тщательно перемешанную с цитратом натрия, вновь набирают в капилляр до метки «К». Капилляр ставят в штатив строго вертикально. СОЭ учитывают через 1 час, при необходимости через 24 часа и выражают в миллиметрах.

Более ста лет данный лабораторный тест применяется для количественного определения интенсивности разнообразных воспалительных процессов. Так, чаще всего увеличение СОЭ связано с воспалительными процессами, отравлениями, инфекциями, инвазиями, опухолями, гемобластозами, кровопотерей, травмами, оперативными вмешательствами.

Хотя воспаление и является наиболее частой причиной ускорения  оседания эритроцитов, увеличение СОЭ  также может обусловливаться  и другими, в том числе и  не всегда патологическими, состояниями.

Несмотря на свою неспецифичность определение СОЭ все еще является одним из наиболее популярных лабораторных тестов для установления факта и интенсивности воспалительного процесса.

 

Определение содержания гемоглобина

Определение содержания гемоглобина  в крови животных является одним  из самых важных и массовых показателей. Для определения гемоглобина  чаще всего анализируют производные  гемоглобина, образовавшиеся в процессе его окисления и присоединения  к гену различных химических групп, приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора.

Для рутинных лабораторных исследований наиболее предпочтительны  колориметрические методы, как наиболее дешевые, простые и быстрые в  исполнении. Кровь животного - это  нормальная смесь производных гемоглобина  с различными спектрами поглощения. При количественном определении  гемоглобина колориметрическими методами возникает проблема в выборе реагента, который превращал бы все производные  гемоглобина только в одну форму  перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, количественно  превращающими гемоглобин в его  производные, оказались гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемиглобиназидный (HbN3), которые при фотометрировании дают наименьшую ошибку определения среди других методов анализа.

Повышение: некоторые формы  гемобластозов, в частности эритремия, обезвоживание организма.

Понижение (анемия): различные  виды анемий, в том числе вследствие кровопотери.

Принцин гемиглобинцианидного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемиглобинцианид. Перевод гемоглобина в гемиглобинцианид осуществляется при его взаимодействии с трансформирующим раствором, содержащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН, при котором реакция проходит за 3-5 минут. Детергент усиливает гемолиз эритроцитов и предотвращает мутность, связанную с белками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы гемоглобина в метгемоглобин, который образует с цианистым калием гемиглобинцианид, имеющий красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну - гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфат натрия, происходит его превращение в окисленную низкоспиновую форму - гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе.

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г./л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

При определении гемоглобина  двумя методами Ахрем А.А. с соавторами показали, что большую точность (и меньшую s) дает гемихромный метод. Авторы предполагают, что SDS способствует солюбилизации мембранных частиц и препятствует адсорбции белка на стекле пробирок и кювет, тем самым обеспечивается высокая точность анализа.

Сравнительная оценка результатов  определения гемоглобина в крови  двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99. Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Выполнение. В сухие чистые пробирки дозатором внести по 5 мл трансформирующего  раствора, к ним прилить по 20 мкл крови поверенной пипеткой Сали или механическим дозатором со всеми предосторожностями, перечисленными в предыдущем разделе. Пробу тщательно перемешать на микровстряхивателе или вручную до достижения гомогенного раствора. Растворы выдержать при комнатной температуре время, указанное в инструкции к набору, и измерить оптическую плотность растворов на поверенном, калиброванном приборе в кювете, имеющей нулевое поглощение дистиллированной воды относительно аналогичной контрольной (с длиной оптического пути 10 мм). Окраска растворов устойчива до 5 час и более, что позволяет проводить измерения в любое удобное время в этом временном интервале. Расчет содержания гемоглобина в крови произвести по калибровочному графику или фактору, определенному на данном приборе. Если соблюдены все перечисленные условия подготовки и проведения анализа, описанные выше, погрешность определения гемоглобина в крови не будет превышать ±2%. Кратко суммируем источники возможных ошибок при определении гемоглобина: использование некалиброванных пипеток и несовершенная техника дозирования проб крови; применение неповеренного оборудования, не обеспечивающего линейную зависимость оптической плотности от концентрации гемоглобина в требуемой области измерений; нестабильность прибора; отсутствие внутрилабораторного контроля качества; недостаточная чистота кювет, особенно проточных; ошибки при построении калибровочных графиков и расчете факторов; использование контрольных растворов гемоглобина низкого качества; ошибки оператора, ошибки, допускаемые на преаналитической фазе.

1. Количественные характеристики клеток крови

Определение количества клеток крови проводится различными методами: с помощью счетных камер, в  мазках крови (подсчет тромбоцитов  на определенное количество эритроцитов), с помощью автоматических устройств. Во всех случаях результаты представляются в виде количества клеток в единице  объема крови. По международной системе  единиц (СИ) число форменных элементов  в крови выражают в расчете на 1 л.

Подсчет клеток с помощью  счетных камер является наиболее распространенным микроскопическим методом. Он основан на использовании разведенной  крови, внесенной в счетную камеру. Все форменные моменты подсчитывается по единому принципу, различие заключается  в степени разведения крови и  применения, различных по составу  разбавителей для эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

Использование счетных камер  делает метод достаточно трудоемким для лабораторных исследований. На точности метода сказывается ошибки при взятии крови, разбавлении ее, неравномерности заполнения камер, нарушение правил подготовки камер к работе и подсчета клеток. Метод требует большого и постоянного напряжения при работе с микроскопом и особенно утомителен при подсчете эритроцитов и тромбоцитов. В то же время камерный метод может быть применен в любых условиях, не требует сложного оборудования и дефицитных реактивов.

Подсчет тромбоцитов в  мазках крови объясняется их малыми размерами и недостаточной четкостью  контуров при подсчете в счетной  камере. Тромбоциты считаются на определенное количество эритроцитов в мазке (чаще на 1000 эритроцитов) с последующим  пересчетом на 1 л крови.

Использование фотометрических  или кондуктометрических принципов  позволило создать автоматические счетчики и гематологические автоматы для лабораторных исследований. Форменные  элементы крови либо перекрывают  световой луч специального сканирующего микроскопа, либо изменяют сопротивление  между электродами капилляра, по которому протекает разбавленная кровь, при этом возникает импульс, регистрируемый счетным устройством.

Гематологические счетчики и автоматы значительно повышают производительность труда и точность исследований, позволяют определять параллельно 7-8 параметров. В то же время  высокая стоимость таких аппаратов, специальные требования к качеству реактивов, высокая производительность и жесткость программ делают рентабельным их использование лишь в условиях крупных лабораторий и стационаров.

Количество эритроцитов  и лейкоцитов в крови здоровых животных колеблется в широких пределах.

 Уменьшение числа эритроцитов  ниже нормативных показателей  является одним из основных  лабораторных симптомов малокровия (анемии). Необходимо отметить, что при анемиях не всегда наблюдается уменьшение количества эритроцитов в крови, т. к. анемия - это уменьшение концентрации гемоглобина в единице объема и, следовательно, при нормальном количестве эритроцитов возможно снижение концентрации в них гемоглобина. Для уточнения характера анемии, кроме анамнеза и клинических данных, необходимы сведения о количестве эритроцитов, концентрации гемоглобина, величине гематокрита, количестве ретикулоцитов, расчетных индексах эритроцитов, морфологии эритроцитов, их объеме и диаметре.

Увеличение числа эритроцитов (эритроцитоз, полицитемия) может наблюдаться  при уменьшении объема циркулирующей  плазмы (гемоконцентрационный, относительный эритроцитоз), а также при активации эритропоэза (абсолютный эритроцитоз).

 

Для крови животных характерно также относительное постоянство  концентрации ионов водорода (рН). Реакция крови убойных животных слабощелочная и колеблется обычно в небольших пределах.

Кровь рН

Коровы . 7,36—7,50

Овцы ….. 7,40—7,58

Барана…….. 7,82

Козы……….. 7,65

Кровь рН

Свиньи……. 7,85—7,95

Лошади…… 7,20—7,60

Кролика .. 7,33—7,40

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.Морфологический состав крови

 

Кровь является внутренней средой организма, которая объединяет между собой органы и ткани  и выполняет дыхательную, питательную, выделительную, регуляторную и защитную функции.

 Кровь животных - это  однородная густая жидкость красного  цвета, состоящая из жидкой  части - плазмы - и форменных элементов  (клеток): эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов.

 Плазма - это жидкость  соломенно-желтого цвета. Форменные  элементы представляют собой  густую массу темно-красного цвета,  который обусловлен наличием  в эритроцитах белка гемоглобина.  Эритроциты составляют основную  массу форменных элементов (около 99 %).

 Содержание форменных  элементов в крови крупного  рогатого скота составляет 33 %, у  мелкого - 28 %, у свиней - 44 % от массы крови.

 Общее количество крови  у крупного и мелкого рогатого  скота составляет в среднем  7,6-8,3 %, у свиней - 4,5-6,0 %, у птицы  - 7,6-10 % к живому весу. При обескровливании  извлекается около 50-60 % этого  количества.