Методы очистки и концентрации вирусов

         Методы очистки и концентрации вирусов.

 

В процессе репродукции  вируса в клетках происходит накопление его в тканях и жидкостях организма животных, однако в вируссодержащем материале доля вируса незначительна. Поэтому при проведении вирусологических исследований иногда приходится использовать специальные методы для очистки вируса от баластных веществ               (остатков тканей,  разрушенных клеток, микробов и т. д.), а иногда и концентрировать вирусы.

 Очистку  и концентрацию вирусов проводят  с целью:

 а) изучить  морфологию вирусов;

 б) получить  очищенные антигены для серологических  реакций;

 в)  получить  высококачественные и эффективные вакцины.

Различают следующие  методы очистки и концентрации вирусов:

I. Физические методы:

1. Термолизис. Применяется для очистки вирусов от тканевых 
элементов и бактерий, широко используется в процессе подготовки 
вируссодержащих суспензий из органов для вирусологических 
исследований. С помощью этого метода освобождают вирусы из 
клеток. Вначале готовят из органов суспензию растиранием в ступке 
со стерильным песком, затем переносят в центрифужные пробирки 
и несколько раз замораживают при низких температурах (-20, - 
50° С) с последующими оттаиваниями при температуре 36-37° С в 
термостате или при комнатной температуре. После последнего 
оттаивания суспензию центрифугируют при 3-4 тыс. оборотов в 
минуту 20-30 минут. Вирус будет находиться в надосадочной 
жидкости. В дальнейшем из такой вируссодержащей жидкости 
вирус можно концентрировать другими методами (например, 
методом       дифференциального       центрифугирования       и 
ультрацентрифугированием).

2. Фильтрация     вируссодержащего   материала     через 
керамические, асбестовые и мембранные (градоколовые) фильтры. 
При этом методе сначала материал фильтруют через различные бактериальные фильтры (Зейтца Шамберлана, Беркефельда) и очищают его от балластных веществ (бактерии, обрывки клеток и других частиц). 
Затем фильтруют через мембранные фильтры с малыми размерами 
пор. При этом вирусы остаются на фильтре (если размер пор меньше 
размера вирусов). Затем фильтр измельчают или растирают с небольшим количеством стерильногофизраствора (или буфера), а затем центрифруют для осаждения частичек фильтра. Вирус будет сконцентрирован в надосадочной жидкости. 

3.  Дифференциальное центрифугирование. Методы центрифугирования основаны на разделении частиц по их массе. Обычно для центрифугирования используют охлажденный вируссодержащий жидкий материал и центрифуги     с охлаждением.      При     дифференциальном

центрифугировании сначала центрифугируют материал при 3-4 тыс. оборотов в минуту 30 минут, надосадочную жидкость собирают в другую пробирку и вновь центрифугируют при более высоких оборотах (5-6 тыс.), жидкость сливают и для осаждения вируса центрифугируют уже затем при 30-60 тыс. оборотов в минуту. Осадок после этого центрифугирования ресуспендируют в небольшом количестве среды и используют в работе.

4. При центрифугировании в градиенте плотности используют разделение частиц по скорости седиментации в вязкой среде (обычно используют 20-60 % сахарозу и др.) и при этом образуются зоны, состоящие из .частиц одного типа.

5. Методы адсорбции вируса с  последующей элюцией. Этот метод 
основан на способности вирусов адсорбироваться, на поверхности 
некоторых веществ или клеток, а в последующем удаляться 
(элюировать) с сорбента при изменении условий (температуры, 
рН среды и т. д.). В качестве сорбентов применяют гидроокись алюминия   
гипс, некоторые бактерии (например, беспигментные штаммы 
чудесной палочки), эритроциты. 

В вирусологических лабораториях для очистки и концентрации 
некоторых вирусов, таких как вирус гриппа в качестве сорбента используют эритроциты животных и птиц. На поверхности эритроцитов вирусы способны адсорбироваться при низкой температуре (+2, +4° С),  а при повышении температуры до 37° С элюируют с поверхности эритроцитов в жидкость.

Обычно на эритроцитах  адсорбируется до 
95% вируса из среды, а элюирует 90-100%. 

 

II . Химические методы

Методы осаждения  вирусов химическими веществами:      

I) Осаждение метанолом, который добавляют к охлажденной вирус-

содержащей жидкости при низких температурах до конечной Концентрации 35 %. Смесь оставляют на 4 часа при +4° С,

[Центрифугируют для  осаждения, а затем растворяют  в буферном растворе.

2) Осаждение    вирусов    в    изоэлектрической    точке. 
Изоэлектрические точки большинства известных вирусов лежат в 
диапозоне рН 3,5-6,5, т. к. вирусные белки в основном кислые. При этом 
методе к вируссодержащей жидкости медленно при  постоянном 
помешивании добавляют 1 н раствор соляной кислоты при 
температуре +4°С и доводят рН среды до изоэлектрической точки 
данного вируса, смесь выдерживают на холоде несколько часов, 
затем центрифугируют для осаждения 20-30 минут при 3-4 тыс. 
оборотов, надосадочную жидкость сливают и осадок разводят в 
слабощелочном буфере.

3) Осаждение солями и полиэтиленгликолем. Для осаждения вирусов обычно используют сернокислые соли магния, натрия и аммония. Наиболее широко применяется сульфат аммония.

К охлажденной  вируссодержащей суспензии добавляют насыщенный раствор сернокислого аммония до определенной концентрации 35 %,  а полиэтиленгликоля до концентрации 7,5 %,

перемешивают  и оставляют на холоде на 16 часов, центрифугируют и осадок растворяют в фосфатном буфере. 

4. Метод Ильенко: с использованием хлороформа или эфира. Метод пригоден для очистки вирусов от липидов и липоидов и применяется чаще для очистки нейротропных вирусов от мозговой ткани.

Из мозговой ткани готовят суспензию и  к ней добавляют равный объем хлороформа или эфира, закрывают резиновой пробкой и тщательно встряхивают для хорошего перемешивания, выдерживают 2 часа в холодильнике при +4° С и центрифугируют 20-30 минут при 3-4 тыс. оборотов в минуту.

Если был добавлен эфир, вирус будет внизу, выше мозговая ткань и липиды, вверху эфир.

При добавлении хлороформа он будет находиться внизу, выше мозговая ткань и в верхнем слое вируссодержащая жидкость. Применяют этот метод для очистки только тех вирусов, которые являются  нечувствительными к хлороформу и эфиру.

 

III биологические методы

1. Для очистки вируссодержашей жидкости от бактерий широко 
   применяют добавление к суспензии антибиотиков пенициллина и 
   стрептомицина, от плесеней и дрожжей добавляют нистатин.
2. Культивирование вирусов в злокачественных опухолях (осцит- 
   карцинома, саркома Крокера и др.), на куриных эмбрионах и в 
   культурах тканей позволяет очистить и накопить вирусы.