Шпаргалка по "Микробиологии"

Более достоверные результаты дает выявление нарастания титра антител в парных сыворотках, полученных от больного в начале заболевания и спустя 3–5 суток и более, когда титр агглютининов повышается под воздействием находящегося в организме патогенного микроба.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнаружения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обычных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчайшим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабатывают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритроцитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пуговицы»

23. Реакция преципитации. Её модификации.

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых количествах, которые не обнаруживаются химическим путем.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические частицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бактериальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению. В РП используются жидкие прозрачные Аг.

Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг. Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикально. При положительной реакции в пробирке на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появляется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг. Она нашла также применение в судебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фальсификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Недостатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формировании преципитата.

Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля. В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном расстоянии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных перекрещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ. Широко используется для диагностики заболеваний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.

24. Реакция связывания  комплемента. Механизм и практическое использование.

Реакция связывания комплемента (РСК) – сложная двухэтапная серологическая реакция. В ней используют пять ингредиентов, составляющих две системы: антиген, антитело, комплемент (первая система); эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) гемолитической сывороткой, содержащей специфические к ним антитела (вторая, или индикаторная, гемсистема). При этом взаимодействие антитела с антигеном на первом этапе реакции приводит к образованию иммунного комплекса, который адсорбирует комплемент, но визуально обнаружить это невозможно. В качестве индикатора связывания комплемента на комплексе антиген–антитело на втором этапе используют гемсистему, которая, являясь иммунным комплексом, тоже способна адсорбировать его. В конечном итоге возможны два варианта результата реакции. Если антитело и антиген соответствуют друг другу и комплемент адсорбируется образовавшимся комплексом, лизиса эритроцитов гемсистемы не произойдет. При несоответствии антитела антигену, и наоборот, комплемент, оставаясь свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет гемолиз.

Как и другие серологические реакции, РСК можно использовать для выявления специфических антител по известному антигену или для определения антигена по известным антителам.

Общая характеристика ингредиентов РСК.

ИССЛЕДУЕМАЯ СЫВОРОТКА перед постановкой реакции прогревается на водяной бане 30 мин для инактивации ее собственного комплемента и разводится начиная с 1:5.

АНТИГЕНОМ могут быть культуры бактерий, их лизаты, вирусы и вирус–содержащие материалы, экстракты патологически измененных органов и тканевые липиды.

КОМПЛЕМЕНТ – сыворотка морских свинок, полученная в день опыта. В настоящее время используется производственный сухой комплемент.

ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки и 3% взвеси эритроцитов барана по осадку. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 30 мин.

Постановка основного опыта РСК. В 1 пробирку вносят СЫВОРОТКУ, АНТИГЕН И КОМПЛЕМЕНТ, во вторую – сыворотку, комплемент и вместо антигена изотонический раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ), в третью – антиген, комплемент и тот же раствор натрия хлорида (КОНТРОЛЬ АНТИГЕНА). Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 1ч. Одновременно готовят гемолитическую систему, которую затем добавляют во все три пробирки после извлечения штатива из термостата. Смешав гемсистему с ингредиентами трех пробирок, последние вновь ставят в термостат на 1 ч, и спустя это время учитывают результаты РСК.

При учете РСК интенсивность реакции обозначается плюсами: «++++»– резко положительная реакция с полной задержкой гемолиза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты осели на дно; «+++», «++» –положительная реакция, отличается нарастанием окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшения количества эритроцитов в осадке; «+» – слабоположительная реакция, жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов. Отрицательная реакция обозначается знаком «–», при этом наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно–розовую окраску («лаковая кровь»).

РСК – весьма сложная, но очень чувствительная специфическая реакция. Широко применяется в диагностике сифилиса, хронической формы гонореи, коклюша, актиномикоза, всех риккетсиозов и вирусных инфекций.

25. Реакция нейтрализации (реакция нейтрализации токсина  антитоксином; реакция вирусной нейтрализации на животных, эмбрионах и клеточных культурах. Механизм и практическое использование).

Идентифицировать вирус по характеру его действия на монослой культуры клеток, которые он разрушает или вызывает в них разного рода структурные изменения, очень трудно, и поэтому прибегают к постановке реакции нейтрализации (РН) вирусов заведомо известными вируснейтрализующими сыворотками. С этой целью полученный от больного вирус накапливают в культуре клеток и различные его разведения смешивают с неразведенной противовирусной сывороткой или, наоборот, постоянную дозу вируса добавляют к различным разведениям иммунной сыворотки. Смеси инкубируют в термостате. После этого смесями вируса и сыворотки заражают культуру клеток и о нейтрализующей силе ее антител судят по отсутствию цитопатического действия на клетки Смесью вирусов и сывороток можно заражать куриные эмбрионы или чувствительных животных. В таких случаях нейтрализующую активность антител определяют по предотвращению развития патологических изменений на хорионаллантоисной оболочке; нейтрализации вирусных гемагглютининов в жидкостях эмбриона, устранению летального действия вируса на животных

Подобным образом с помощью РН идентифицируются вирусы, выделенные из материала больных при заражении им куриных эмбрионов и животных. В таких случаях к вируснейтрализующим сывороткам прибавляют вируссодержащие жидкости эмбрионов и взвеси пораженных органов животных. После определенного времени инкубации смесями инфицируют культуры клеток, куриные эмбрионы и животных.

В серодиагностике вирусных инфекций РН определяют вирус–нейтрализующие антитела в сыворотке больных по известному вирусу. Ставят ее в динамике с парными сыворотками, одну из которых берут в разгаре заболевания, а вторую – спустя 2–3 недели, и по четырехкратному нарастанию титра антител в этой последней подтверждают диагноз.

26. Иммуноферментный анализ. Механизм и практическое использование.

Метод был разработан в начале 70-х гг независимо друг от друга тремя группами учёных. Метод напоминает РИА, но в его основу положено маркирование Аг или Ат, вступающего в реакцию, ферментом. Взд метки с субстратом обычно сопровождается изменением окраски среды. В настоящее время созданы многочисленные модификации этого метода, но наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный). Различают:

ПРЯМОЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА. В этом случае:

сыворотку с Ат инкубируют с Аг, фиксированным на твёрдом субстрате (чаще всего это пластиковая микропланшетка).

Ат, не связавшие Аг, удаляют многократным промыванием.

Вносят меченную ферментом сыворотку к Ат, связавшим Аг.

Определяют ко-во фермента–маркёра, связавшегося с Ат.

КОНКУРЕНТНЫЙ ТВЕРДОФАЗНЫЙ ИФА.

Вносят сыворотку. Если в ней есть специфические Ат, то они связываются с Аг, фиксированном на твёрдом субстрате. Если специфических Ат нет, то Аг оказывается не связанным.

При добавлении специфических к фиксированному Аг Антител в первом случае им будет не с чем взаимодействовать (большинство Аг уже связаны) Þ содержание маркёра низкое. Во втором случае специфические Ат будут связываться с Аг и при отмывании они не будут смываться Þ высокое содержание маркёра.

Аналогично м.б. фиксированы АНТИТЕЛА, и различные фирмы выпускают именно планшеты с уже фиксированными Ат.

По сравнению с классическими методами выявления Аг этот метод позволяет непосредственно регистрировать их взаимодействие с Ат, а не вторичные проявления (агглютинацию, преципитацию или гемолиз). Метод очень ЧУВСТВИТЕЛЕН (достаточно концентрации 1нг/мл).

Определяют: Хламидии, клостридии, ВИЧ и др.

27. Реакция торможения  гемагглютинации. Механизм и практическое использование.

Многие вирусы обладают способностью агглютинировать эритроциты строго определенных видов млекопитающих и птиц. Так, вирусы гриппа и эпидемического паротита агглютинируют эритроциты кур, морских свинок, человека, а аденовирусы – эритроциты крыс, мышей. В связи с этим для их обнаружения в материале больных или культурах клеток, эмбрионов и животных ставят реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунках планшетов готовят двукратно возрастающие разведения вируссодержащих материалов и жидкостей, добавляя к ним отмытые изотоническим раствором взвеси NaCl эритроцитов. Для контроля спонтанной агглютинации эритроциты смешивают ещё с равным объемом изотонического раствора NaCl. Смеси инкубируют в термостате при температуре 37°С или при комнатной температуре.

Результаты РГА учитывают по характеру агглютинации эритроцитов через 30–60 мин, когда они обычно полностью осаждаются в контроле. Положительная реакция обозначается плюсами. «++++» –осадок в виде «зонтика», «+++» – осадок с просветами, «++» – осадок с большими просветами, «+» –хлопьевидный осадок, окруженный зоной скомкованных эритроцитов, и «–» – такой же резко очерченный осадок эритроцитов в виде «пуговицы», как и в контроле

Являясь группоспецифической, РГА не дает возможности определить видовую принадлежность вирусов. Их идентифицируют с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА). Для ее постановки используют заведомо известные иммунные противовирусные сыворотки, которые в двукратно снижающихся концентрациях разводят в изотоническом растворе натрия хлорида и разливают по лункам. К каждому их разведению добавляют равное количество вируссодержащей жидкости. Контролем является взвесь вируса в изотоническом растворе натрия хлорида. Планшеты со смесью сывороток и вируса выдерживают в термостате 30 мин или при комнатной температуре 2 ч, затем в каждую из них добавляют взвесь эритроцитов. Спустя 30 мин определяют титр вируснейтрализующей сыворотки (т.е. максимальное ее разведение), вызвавшей задержку агглютинации эритроцитов.

Используют РТГА в серологической диагностике вирусных болезней, в частности гриппа и аденовирусных инфекций. Ставить ее лучше так же, как и РН, с парными сыворотками. Четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке подтверждает предполагаемый диагноз

28. Реакции фагоцитоза. Практическое использование реакции фагоцитоза при оценке иммунного статуса.

Фагоцитоз осущ-ся микрофагами и макрофагами. Стадии фагоцитоза: приближение, прилипание, погружение, переваривание.

Оценка функциональной активности фагоцитирующих клеток.

Колич. оценку фагоцитарной активности гранулоцитов и моноцитов производят в цельной крови, в лейкоцитарной взвеси или в обогащенных фракциях фагоцитирующих клеток. В качестве стандартных объектов фагоцитоза используют монодисперсные частицы латекса диаметром 1,0-2,0 мкм, суспензию убитых нагреванием бактерий или дрожжеподобных грибов.

Фагоциты смешивают с фагоцитируемым материалом в соотношении 1:10 или 1:100 и инкубируют при 37°С в течение 30 мин при постоянном перемешивании. Затем пробирки центрифугируют и осадок ресуспензируют в капле сыворотки крови для приготовления мазка. В мазках, фиксированных краской Май-Чрюнвальда и окрашенных по Романовскому-Гимзе, подсчитывают процент фагоцитирующих клеток (ФП – фагоцитарный показатель) и кол-во поглощенных частиц на 1 клетку (ФЧ – фагоцитарное число).

У здорового человека ФП=40-80%, ФЧ=1-5.

29. Молекулярно-генетические  методы обнаружения возбудителей инфекции в организме (ДНК и РНК зондирование, полимеразная цепная реакция).