Молекулярная генетика

У многоклеточных организмов генетическая регуляция синтеза белка сложнее и пока изучена недостаточно. Однако ясно, что и здесь большую роль играет обратная связь, подобная описанной у бактерий для системы эффектор — регуляторный белок — оператор, причём сигнальными веществами в ряде случаев служат гормоны.

С развитием молекулярной генетики более глубоким стало понимание мутационного процесса, то есть изменения генетической информации. Было показано, что мутации представляют собой либо замены отдельных нуклеотидов, либо вставки или выпадения нуклеотидов в молекуле ДНК. Мутации возникают как вследствие случайных ошибок при репликации ДНК, так и в результате повреждающего нуклеиновые кислоты действия различных физических и химических агентов — мутагенов.

 Они возникают также из-за изменений так называемых генов-мутаторов, кодирующих ферменты, участвующие в репликации, исправляющие генетические повреждения и др. Вызываемые мутагенами изменения химической структуры ДНК либо непосредственно представляют мутации, либо ведут к возникновению мутаций вследствие обусловленных этими изменениями ошибок в ходе последующей репликации ДНК. Значительная доля молекулярных повреждений ДНК, вызываемых мутагенами, не реализуется в мутации, а исправляется (репарируется).

Суть явления репарации состоит в том, что у всех организмов имеются гены, кодирующие особые ферменты, способные "узнавать" поврежденные участки ДНК, "вырезать" их из молекулы и заменять полноценными. Некоторые из этих ферментов идентифицированы, установлен и механизм их действия, но полного понимания процесса репарации ещё не достигнуто.

Изучение репарации открыло новые подходы к исследованию механизма рекомбинации сцепленных (то есть лежащих в одной хромосоме) генов, представляющей одну из причин комбинативной изменчивости, которая наряду с мутациями играет важную роль в эволюции. Классической генетикой было показано, что рекомбинация сцепленных генов происходит путём обмена гомологичных хромосом участками (кроссинговер), но тонкий механизм такого обмена оставался неизвестным. Экспериментальные данные последних 10—15 лет позволяют рассматривать внутрихромосомную и внутригенную (межсайтовую) рекомбинацию как ферментативный процесс, происходящий при взаимодействии молекул ДНК. Акт рекомбинации осуществляется путём разрывов и соединения в новом сочетании отрезков полинуклеотидных нитей. При этом разрывы с последующим воссоединением могут происходить как одновременно в обеих нитях ДНК (кроссинговер), так и в пределах одной нити (так называемых полукроссинговер). Чтобы имел место кроссинговер, так же как и для репарации, необходимы разрывы, репарационный синтез поврежденных участков и восстановление нарушенных фосфатных связей, осуществляемые соответствующими ферментами.

Молекулярная генетика своими замечательными открытиями оказала плодотворное влияние на все биологические науки. Она явилась той основой, на которой выросла молекулярная биология, значительно ускорила прогресс биохимии, биофизики, цитологии, микробиологии, вирусологии, биологии развития, открыла новые подходы к пониманию происхождения жизни и эволюции органического мира. Вместе с тем молекулярная генетика, позволившая глубоко проникнуть в природу важнейших жизненных процессов и успешно продолжающая их исследование, отнюдь не претендует на решение многих, в том числе и генетических, проблем, касающихся целостного организма, а тем более совокупностей организмов — популяций, видов, биоценозов и так далее, где преобладают закономерности, изучение которых требует иных методов, чем те, какие использует молекулярная генетика

Достижения, внёсшие огромный теоретический вклад в общую биологию, несомненно будут широко использованы в практике сельского хозяйства и медицины (так называемая генная инженерия путём замены вредных генов полезными, в том числе искусственно синтезированными; управление мутационным процессом; борьба с вирусными болезнями и злокачественными опухолями путём вмешательства в процессы репликации нуклеиновых кислот и опухолеродных вирусов; управление развитием организмов посредством воздействия на генетические механизмы синтеза белка ).

Перспективность практического применения достижений молекулярной генетики подтверждается успехами, достигнутыми на модельных объектах.

Так, у наиболее изученных в генетическом отношении видов бактерий удаётся получать мутации любого гена, лишать клетку какого-либо гена или привносить в неё желаемый ген извне, регулировать функции многих генов. Несмотря на то что генетические свойства клеток эукариотов изучены на молекулярном уровне ещё недостаточно, увенчались успехом первые попытки введения некоторых генов в клетки млекопитающих с помощью вирусов, осуществлена гибридизация соматических клеток и др.

 Например, в 1971 американский учёный  С. Меррилл с сотрудниками, культивируя  вне организма клетки человека, больного галактоземией (такие клетки неспособны вырабатывать один из ферментов, необходимых для утилизации молочного сахара, что и является причиной этой тяжёлой наследственной болезни), ввели в эти клетки неинфекционный для них бактериальный вирус, содержащий ген, кодирующий данный фермент. В результате клетки "излечились" — стали синтезировать недостающий фермент и передавать эту способность последующим клеточным поколениям. Уже сейчас данные молекулярной генетики используют при создании медикаментов, применяемых для профилактики и лечения новообразований, лейкозов, вирусных инфекций, лучевых поражений, при изыскании новых мутагенов и так далее.

Глава 3. Проблемы и перспективы молекулярной генетики[3]

Молекулярная генетика призвана расшифровывать структуры геномов, генов, механизмы их воспроизводства и реализации информации, закодированной в этих структурах. Эта область науки исследует также механизмы изменчивости генома, лежащие в основе эволюции и биологического разнообразия. С практической точки зрения, молекулярная генетика лежит в основе современной биотехнологии, диагностики и лечения болезней, интенсификации сельского хозяйства и охраны окружающей среды.  
С развитием технологий молекулярных исследований, начавшимся в начале 70-х годов прошлого века, с введением быстрых методов секвенирования и генно-инженерных способов клонирования фрагментов ДНК, темпы развития молекулярной генетики приняли стремительный характер и привели к возникновению в конце 80-х годов программы "Геном человека". Этот глобальный проект предполагает к 2005 г. завершить определение полной последовательности всех 3 млрд нуклеотидных звеньев, составляющих геном человека. Введение его в действие означало, что техническое развитие молекулярных исследований в области наук о жизни достигло качественно нового уровня, позволяющего решать принципиально новые задачи. Комплекс исследований молекулярных основ жизнедеятельности, в который входит и молекулярная генетика, изменил свое лицо идеологически и технически.

 
Идеологически произошел сдвиг:  
от исследований отдельных генов к исследования целых геномов, от генетики скрещивания к парасексуальной генетике (термин, определяющий исследования, основанные на введении генетического материала в клетку или в целый организм неполовым путем и на создании условий для его последующей передачи по наследству);  
от классической прямой генетики, двигавшейся к идентификации генов от признаков, кодируемых этими генами, к "обратной" генетике, которая сначала идентифицирует фрагмент генома, а уже затем занимается выяснением, какой признак определяет этот фрагмент;  
от работы с изолированными генами или продуктами их экспрессии к изучению их эффектов на уровне целого организма, в котором роль этих продуктов осмысливается в контексте комплекса их природных взаимосвязей.  
 
Технически стал возможным переход:  
к направленному воздействию на генетический аппарат клетки или целого организма, приводящему к его наследственному изменению;  
к исследованиям структур отдельных молекул путем их избирательной амплификации;  
к методам эволюции в пробирке: направленному систематическому изменению свойств взаимодействующих молекул, позволяющему достигать их максимального взаимодействия;

 
От традиционных белковых ферментов к искусственным ферментам полинуклеотидной природы 
к тотальной автоматизации и роботизации экспериментальной работы и к максимальному переносу груза анализа экспериментальных результатов на компьютер;  
к созданию интегральных информационных баз данных, позволяющих быстро сопоставлять структуры новых продуктов с уже существующими и на основании гомологии делать предварительные выводы об их возможной функциональной роли.  
 
Началась эпоха интегральных исследований геномов, которые образовали специфический раздел молекулярной генетики - геномику. Геномика сегодня занимается анализом структуры и функций геномов как интегрального функционального массива генов, их регупяторных элементов и других последовательностей, необходимых для функционирования генома. В круг ее интересов входит также анализ появившихся и закрепившихся в геноме паразитических эгоистических элементов, значимость которых для существования и эволюции геномов еще предстоит узнать. Начавшись с исследований генома человека, геномика значительно расширила диапазон своих интересов и включила в них множество модельных организмов - бактерии и дрожжи, нематоду, дрозофилу и мышь, геномы которых исследуются и сравниваются между собой для расшифровки структурных основ их функциональной организации. Возникло единое пространство геномной информации, которое стремительно наращивает свой информационный потенциал. Сравнительный анализ структур геномов различных организмов составляет отправную точку для функциональной геномики, которая призвана определять функциональную значимость вновь определяемых последовательностей. Концепция "в гомологии структур зашифрована аналогия функций" оказывается весьма плодотворной и помогает устанавливать функции генов человека на основании известных функций генов модельных организмов. Таким образом, современная молекулярная генетика оперирует в едином геномно-информационном поле, где информация о функциях генов в различных организмах интегрируется и распространяется на другие организмы.  
Анализ функций генов не ограничивается только пассивным сравнением их структур. Функциональный смысл идентифицированной последовательности с характерными особенностями, присущими гену, может анализироваться и путем ее модификации in vitro, введения модифицированного варианта в клетки или в животных и исследования эффекта вариации последовательности на свойства клеток или животных. Современная молекулярная генетика использует для этих целей широкий диапазон методов генетики соматических клеток и трансгеноза, включая создание так называемых нокаутированных животных, у которых направленно удаляется исследуемая последовательность или блокируется ее функция. Наконец, продукт, кодируемый данной последовательностью, может быть получен методами генетической инженерии, и его свойства могут исследоваться стандартными биохимическими приемами и изменяться методами белковой инженерии. Функциональная геномика развивается чрезвычайно быстро, но, поскольку функциональный анализ всегда требует больших временных затрат при меньшей определенности и однозначности результатов, можно предсказать, что функциональный анализ геномов займет очень значительное время после установления структуры геномов человека и модельных организмов.  
Важнейшую роль в структурных исследованиях генома играет изучение его полиморфизма. Этот раздел молекулярной генетики является основой для понимания принципов молекулярной эволюции, механизмов возникновения патологических мутаций, для оценки факторов риска при воздействии потенциальных токсических агентов окружающей среды на человеческий организм, наконец, для понимания основ различной индивидуальной восприимчивости лекарств. Эти исследования получили новый импульс с открытием полиморфных мини- и микросателлитов, которые позволили осуществить тонкое генетическое картирование генома и в конечном счете создать интегрированные карты генома, объединяющие физические и генетические карты генома человека в единую систему. Это в свою очередь привело к развитию методов позиционного клонирования, которые позволяют быстро клонировать гены, начав с исследования их сегрегации в семьях.  
Современная геномика была бы невозможной без развития систем клонирования крупных фрагментов генома в специальных векторах, способных реплицироваться в клетках вместе со встроенными в них фрагментами. К таким векторам относятся, в частности, искусственные дрожжевые хромосомы (YAC), появление которых стало возможным благодаря развитию молекулярной генетики дрожжей. В результате их появления геном удалось разбить на фрагменты длиной примерно 106 пар оснований, которые в составе YAC находятся в библиотеках генов. Каждый фрагмент в этой библиотеке картирован, т.е. приписан к определенному участку хромосом. Это создает предпосылки для быстрого выделения нужного фрагмента генома для работы in vitro как для структурного, так и для функционального анализа. Наличие библиотек фрагментов лежит в основе определения первичной структуры всего генома.  
Хотя интегральные исследования генома играют все возрастающую роль, это не означает потери актуальности исследований конкретных генов и механизмов их экспрессии. Накапливается информация о генах, играющих центральную роль в регуляции клеточной жизнедеятельности, таких как гены контроля клеточного цикла или гены, кодирующие компоненты передачи сигнала от клеточной поверхности аппарату транскрипции в клеточном ядре. О генах, контролирующих развитие эмбрионов. О генах, ответственных за работу защитных систем организма, генах иммунной системы. Расширяется представление о генах, повреждение которых приводит к возникновению раковых опухолей, онкогенах, генах-супрессорах и генах клеточной смерти, апоптоза. Наконец, все более детальным становится знание строения аппаратов транскрипции бактериальных и эукариотических клеток и надмолекулярных уровней регуляции экспрессии, включая эффект положения, инсупяцию и т.д.  
Это введение было бы неполным без упоминания о той чрезвычайно важной роли, которую играют компьютерные методы хранения и анализа информации, быстро возрастающей по мере развития молекулярной генетики и геномики. Созданные и расширяющиеся базы данных позволяют осуществлять быстрый сравнительный анализ вновь появляющихся данных и существенно облегчают функциональные выводы на основе сравнительного структурного анализа.  
Стремительное накопление фундаментальной информации имеет немедленные и глубокие практические последствия для биотехнологии, медицины и сельского хозяйства и множества других жизненно важных проблем, из которых, возможно, важнейшей является экология.

 
В области биотехнологии молекулярная генетика создает фундаментальные основы для создания продуцентов различного рода веществ по двум направлениям.

Во-первых, в ходе идентификации новых генов человека и других организмов выявляются все новые биорегуляторы и их рецепторы, которые можно использовать в качестве лекарственных препаратов для ветеринарии и медицины.

  Во-вторых, совершенствуются системы  экспрессии различного рода генов в разнообразных клетках и организмах, что в свою очередь создает две перспективы: создание клеток (бактериальных и эукариотических) и организмов (растений и животных), продуцирующих различного рода вещества, которые далее могут использоваться как лекарства, пищевые добавки, ферменты в заводских процессах или компоненты диагностикумов или вакцин, а также для создания организмов с улучшенными свойствами, например, трансгенных растений, устойчивых к засухам или имеющих повышенную переносимость к засоленным почвам, или животных, устойчивых к инфекциям. Наиболее впечатляющим достижением в области создания новых продуцентов можно назвать создание живых ферментеров — животных, секретирующих лекарственные препараты в молоко. Развитие технологий создания трансгенных животных делает процедуру создания такого ферментера достаточно рутинной. Эти технологии базируются на достижениях генетики соматических клеток и в последнее время намечается тенденция использования для этих целей систем клонирования животных. Можно сказать, что развитие молекулярной генетики перевело биотехнологию на уровень целых организмов, заложило предпосылки экологически чистых технологических процессов и интенсивных сельскохозяйственных технологий. Это особенно важно ввиду намечающихся демографических и экологических кризисов перенаселенной планеты.  
 
Возможно, наиболее ярко практический потенциал молекулярной генетики проявляется в биомедицинских исследованиях. Здесь развитие молеку-лярно-генетических подходов также многопланово:  
идентификация генов, ответственных за возникновение заболеваний, наследственных и приобретенных;  
анализ генетических систем, ответственных за метаболизм лекарственных препаратов в организме (фармакокинетику), их полиморфизма и корреляции этого полиморфизма с различной устойчивостью индивидуумов и популяций к действию лекарственных препаратов;

 
Анализ генетических систем, кодирующих мишени воздействия лекарственных препаратов в организме (фармакодинамику), их полиморфизма и роли этого полиморфизма в различной восприимчивости к лекарствам;  
развитие систем лечения, основанных на введении в организм новой генетической информации, призванной исправлять наследственные или приобретенные генетические дефекты или подавлять генетические изменения, связанные с проникновением инфекционных агентов (генная терапия);