Выделение и анализ плазмидной ДНК из бактериальных клеток

Выделение и анализ плазмидной ДНК из бактериальных клеток

 

Выполнила: Бегалиева Ж.

Малярия

 

Р.vivax

 

Р.ovale

 

Р.falciparum.

 

Р.malariae

 

Этиология

 

Эпидемиология

 

Источник – больной человек и гаметоноситель. Переносник – комар Anopheles.

Пути передачи – трансмиссивный, трансфузионный, вертикальный.

Восприимчивость – 100%. Иммунитет – нестерильный, кратковременный.

 

Патогенез

 

спрозоит

 

кровь

 

Печень (тканевая

шизогония) тканевой мерозоит

 

 

Эритроцит (эритроцитарная

шизогония) эритроцитарный мерозоит

 

гамонты

 

Клиника

 

гепатит

 

пароксизм

 

анемия

 

спленомегалия

 

желтуха

 

гипотония

 

Осложнения

 

ОПН

 

малярийная кома

 

алгид

 

Гемоглобинурийная лихорадка

 

розрыв селезенки

 

тифоид

 

острый гепатит

 

геморрагический синдром

 

Специфическая диагностика

 

Микроскопия крови

 

РНИФ, ИФА, РНГА

 

Лечение

 

Профилактика

 

геметошизотропные

 

гистошизотропные

 

гамотропные

 

5% р-р глюкозы

 

кристаллоидиы

 

антипиретики

 

мочегонные

 

Этиотропное

 

Патогенетическое

 

Общая (борьба с комарами)

 

Індивідуальний захист від комах

 

препараты Fе

 

Химиопрофилактика

Плазмиды — внехромосомные мобильные генетические структуры бактерий, представляющие собой замкнутые кольца двунитчатой ДНК. По размерам составляют 0,1—5 % ДНК хромосомы. Плазмиды могут включаться (интегрировать) в хромосому и реплицироваться вместе с ней. Различают:  трансмиссивные и нетрансмиссивные плазмиды. Трансмиссивные (конъюгативные) плазмиды могут передаваться из одной бактерии в другую.

 

Хромосомная ДНК (1) и плазмиды (2) в бактериальной клетке

Среди фенотипических признаков,  бактериальной клетке плазмидами, можно выделить следующие:

• 1) устойчивость к антибиотикам;
• 2) образование колицинов;
• 3) продукция факторов патогенности;
• 4) способность к синтезу антибиотических веществ;
• 5) расщепление сложных органических веществ;
• 6) образование ферментов рестрикции и модификации.

 

Методы выделения плазмидной ДНК основаны на том, что бактериальные плазмиды находятся в кольцевой замкнутой форме и имеют небольшие размеры по сравнению с геномной ДНК.

Из различных методов  выделения плазмид наиболее широко используется метод щелочного лизиса бактерий (метод Бирнбойма – Доли) и его модификации, как для получения мини-препаратов, так для крупномасштабного выделения ДНК.

Метод основан на том, что  в щелочных условиях (~рН 12,0–12,5) происходит денатурация линейных молекул ДНК (расплетение двойной спирали), в то время как кольцевые замкнутые молекулы не денатурируют или денатурируют незначительно и обратимо. Когда клеточный экстракт нейтрализуют при высокой концентрации соли, белки, геномная  ДНК и клеточная РНК осаждаются.

в качестве векторов используют искусственные хромосомы человека. Исследуемый фрагмент ДНК встраивается в соответствующий вектор. Вектор доставляет этот фрагмент в клетку хозяина (обычно бактериальные клетки для облегчения встраивания вектора  обрабатывают специальным методом), где он проходит независимую от хозяина  репликацию, так что образуются многочисленные копии исследуемого фрагмента ДНК  или, иными словами, происходит его  клонирование.

 

Создание рекомбинантных молекул дало возможность анализа ДНК растений и животных. Теперь путем случайного

встраивания множества рестрикционных фрагментов ДНК в подходящие бактериальные плазмиды (эта процедура была названа «методом дробовика») можно с большой вероятностью получить клон, содержащий интересующий нас ген или какую-либо регуляторную последовательность. При этом нужно уметь из множества клонов отобрать интересующий исследователя.

• Выделение генов (отдельных фрагментов ДНК) из клеток бактерий, растений или животных.
• Соединение (сшивание) отдельных фрагментов ДНК любого происхождения в единую молекулу в составе плазмиды;
• Введение гибридной плазмидной ДНК, содержащей нужный ген, в клетки хозяина;
• Копирование (клонирование) этого гена в новом хозяине с обеспечением его работы.