Генная инженерия

 

 

 

 

2.2.Получение рекомбинантной ДНК.

Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про- или эукариот и там автономно репли-цироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, которые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных признаков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК).

При решении ряда научных и биотехнологических задач конструирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена.

Существует три основных способа встраивания чужеродной ДНК в векторные молекулы. В первом случае 3'-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). 3'-концы линейной формы векторной ДНК тем же способом наращиваются комплементарной ей гомополинуклеотидной последовательностью (то есть поли (А)). Это позволяет соединить две молекулы ДНК путем комплементарного спаривания искусственно полученных "липких" концов.

Во втором случае "липкие" концы создаются с помощью расщепления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз). Рестриктазы характеризуются исключительно высокой специфичностью. Они "узнают" в ДНК последовательность из нескольких нуклеотидных остатков и расщепляют в них строго определенные межнуклеотидные связи. Поэтому даже в ДНК больших размеров рестриктазы вносят ограниченное число разрывов. Третий способ представляет собой комбинацию двух первых, когда липкие концы ДНК, образованные рестриктазой, удлиняются синтетическими последовательностями .Концы фрагментов ДНК можно превратить в "липкие", наращивая их двутяжевыми олиго нуклеотидами ("линкерами"), в состав которых входит участок узнавания рестрикта- зой. Обработка такого фрагмента данной рестриктазой делает его пригодным для встраивания в векторную молекулу ДНК, расщепленную той же рестриктаэой. Часто в качестве "линкера" применяются полинуклеотидные фрагменты, которые содержат специфические участки сразу для нескольких рестриктаз (их называют "полилинкерами"). После встраивания чужеродной ДНК в вектор их ковалентное сшивание осуществляется ДНК-лигазой. Если же размер бреши в рекомбинированной молекуле превышает одну фосфодиэфирную связь, она застраивается in vitro с помощью ДНК-полимеразы или in vivo с помощью репарирующих систем клетки.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

          

 

2.3.Введение рекомбинантной ДНК в клетку – реципиент

Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформации или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетических свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК. Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобретают патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонстрирована и изучена у различных видов бактерий. Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную ДНК и синтезирующие особый трансформирующий белок). Компетентность клетки определяется также факторами внешней среды. Этому может способствовать обработка клеток полиэтиленгликолем или хлоридом кальция. После проникновения в клетку одна из нитей рекомбиантной ДНК деградирует, а другая за счет рекомбинации с гомологичным участком реципиентной ДНК может включиться в хромосому или внехромосомную единицу. Трансформация является наиболее универсальным способом передачи генетической информации и имеет наибольшее значение для генетических технологий. Конъюгация – один из способов обмена генетического материала, при котором происходит однонаправленный перенос генетической информации от донора к реципиентуПеренос информации от донорской клетки в реципиентную осуществляется через специальные половые ворсинки Передача всего набора генов вируса или фага, приводящая к развитию в клетке фаговых частиц, называется трансфекцией. Методика применительно к бактериальным клеткам включает получение сферопластов, очистку инкубационной среды от нуклеаз и добавление очищенной фаговой ДНК. Методика применима к животным и растительным клеткам с участием специальных челночных вирусных векторов.

 

3. Применение генно-инженерных технологий в медицине.

  В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

Задача изменения генома взрослого человека несколько сложнее, чем выведение новых генно-инженерных пород животных, поскольку в данном случае требуется изменить геном многочисленных клеток уже сформировавшегося организма, а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для этого предлагается использовать вирусные частицы в качестве вектора. Вирусные частицы способны проникать в значительный процент клеток взрослого человека, встраивая в них свою наследственную информацию; возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генно-инженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генно-инженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.

С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генно-инженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — игрунка обыкновенная.

Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия/ Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.

Однако возможность внесения более значительных изменений в геном человека сталкивается с рядом серьёзных этических проблем.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                             Заключение

В результате интенсивного развития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК, гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее.

Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.

На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная «индустрией ДНК». Это одна из современных ветвей биотехнологии.

Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.

 

 

ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА:

 

1) Бекиш О.-Я.Л. Медицинская  биология. – Мн.: Ураджай, 2000. – с.114-119.

2) Мутовин Г.Р. Основы клинической  генетики. – М.: Высшая школа, 1997. – с. 83-84.

3) Заяц Р.С. Основы медицинской генетики. – Мн.: Высшая школа, 1998. – с. 60-65.

4) biotechnolog.ru