Иммобилизация и стабилизация ферментов

ГБОУ ВПО МЗ РФ «Сибирский государственный медицинский университет»

Кафедра фармацевтической технологии

 

 

 

 

Иммобилизация и стабилизация ферментов

 

Курсовая работа

 

 

 

 

 

 

 

                                                                                    Выполнил: студент 6 курса

                                                                                                                 С. В. Ящук

                                                                        Проверил: доцент кафедры фармацевтической технологии

                                                                                                            В. В. Шейкин

 

Томск 2014

 

 

Содержание:

 

1. Введение ……………………………………………………………	стр. 3
2. История изучения ферментов……………………………………..	стр. 4
3. Функции ферментов………………………………………………..	стр. 5
4. Классификация ферментов………………………………………...	стр. 6
5. Понятие иммобилизации.  Иммобилизованные ферменты……...	стр. 10
6. Методы иммобилизации  ферментов………………………………	стр. 13
7. Ферментные электроды…………………………………………….	стр. 18
8. Применение ферментных электродов….…………………………	стр. 19
9. Стабилизация ферментов…………………………………………..	стр. 20
10. Заключение………………………………………………………...	стр. 23
11. Список использованной  литературы…………………………...	стр. 24

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение.

 

В последние годы в клинической медицине достигнуты определенные успехи в лечении ряда заболеваний внутренних органов, внедряются новые методы терапии в ревматологии, гинекологии, урологии, ангиологии, травматологии и др. При этом продолжается поиск таких препаратов, которые были бы высокоэффективными при лечении больных с различными заболеваниями, обладали малым спектром побочных эффектов и легко переносились при длительном приеме.

Весьма перспективной в решении данной проблемы является системная энзимотерапия. Внедренная в клиническую практику за рубежом более 25 лет тому назад М. Вольфом и К. Рансбергером, она показала свою эффективность при лечении и профилактике многих заболеваний. В последнее время в нашей стране она начинает приобретать все большую известность. В настоящее время накоплен опыт отечественных ученых в использовании системной энзимотерапии и в ревматологии (при ревматоидном артрите, ювенильном ревматоидном артрите, системной красной волчанке, системных васкулитах и др.), в сосудистой хирургии (для лечения тромбофлебитов, перифлебитов, атеросклеротическом поражении сосудов и др.), в гинекологии и урологии (при урогенитальных хламидиозах, хронических аднекситах и др.), травматологии и ортопедии (в лечении травм, переломов костей, эндопротезировании тазобедренных суставов и др.), спортивной медицине (при спортивных травмах и др.).

Метод системной энзимотерапии основан на кооперативном терапевтическом воздействии целенаправленно составленных смесей гидролитических ферментов растительного и животного происхождения. Благодаря влиянию на ключевые патофизиологические процессы в организме, препараты системной энзимотерапии обладают противовоспалительным, противоотечным, фибринолитическим иммуномодулирующим и вторично анальгезирующим действием.

Кроме того, назначение энзимных препаратов приводит к снижению активности воспалительных процессов и модуляции физиологических защитных реакций организма.

При непосредственном участии гидролитических ферментов  уменьшается инфильтрация интерстициального пространства белками плазмы и увеличивается элиминация белкового детрита и депозитов фибрина в области воспаления. Это обеспечивает улучшение микроциркуляции в зоне повреждения и уменьшение локального отека. Благодаря комплексному воздействию на отдельные компоненты иммунопатологических процессов посредством влияния на клеточный (субполяции Т-лимфоцитов, лимфокины) и гуморальный (В-лимфоциты, иммуноглобулины) иммунитет, способности расщеплять циркулирующие в крови и фиксированные в тканях иммунные комплексы, оказывать регулирующее влияние на компоненты комплемента и адгезивные молекулы, а также выраженному противовоспалительному эффекту и улучшению реологических свойств крови энзимы широко используются в лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Доказана способность энзимных препаратов повышать локальную концентрацию антибиотиков в тканях, а также  улучшать переносимость полихимиотерапии при онкопатологии.

Многочисленные клинические испытания показали, что энзимные препараты удовлетворяют всеобщему терапевтическому принципу: надежность и высокая эффективность при общей хорошей переносимости, что и определяет их широкий спектр клинического использования.

 

 

История изучения ферментов.

 

Более ста лет назад термины «фермент» и «энзим» отражали различные точки зрения в теоретическом споре Л. Пастера с одной стороны, и М. Бертло и Ю. Либиха – с другой, о природе спиртового брожения. Собственно ферментами (от лат. fermentum – закваска) называли «организованные ферменты» (то есть сами живые микроорганизмы), а термин «энзим» (от греч. ἐν- – в- и ζύμη – дрожжи, закваска) предложен в 1876 году В. Кюне для «неорганизованных ферментов», секретируемых клетками, например, в желудок (пепсин) или кишечник (трипсин, амилаза). Через два года после смерти Л. Пастера в 1897 году Э. Бухнер опубликовал работу «Спиртовое брожение без дрожжевых клеток», в которой экспериментально показал, что бесклеточный дрожжевой сок осуществляет спиртовое брожение так же, как и неразрушенные дрожжевые клетки. В 1907 году за эту работу он был удостоен Нобелевской премии. Впервые высокоочищенный кристаллический фермент (уреаза) был выделен в 1926 году Дж. Самнером. В течение последующих 10 лет было выделено ещё несколько ферментов, и белковая природа ферментов была окончательно доказана.

Ферментные белки, обладая малостойкой структурой, весьма чувствительны к изменениям рН и температуры. Для каждого фермента существует оптимум значения рН, при котором скорость катализируемой реакции максимальна. Так, активность трипсина имеет оптимум при значении рН 7,8; панкреатической амилазы – при рН 6,4-7,2. Отклонение значения рН в ту или иную сторону ведет к снижению скорости ферментативной реакции. Ферменты, оптимальное значение которых находится в нейтральной или щелочной средах, полностью инактивируются кислым содержимым желудка.

Оптимальное значение температуры для большинства ферментов – 20-40°С. Повышение температуры до 40-50°С, как правило, приводит к падению ферментативной активности, а иногда и к полной денатурации ферментов.

При производстве ферментных препаратов наряду с применением высокоэффективных научно обоснованных способов получения особенно необходима высокая культура производства, строгое соблюдение режимов технологии. Большое внимание уделяется стабилизации ферментов, как на стадии получения субстанции, так и в лекарственной форме. В настоящее время используют три основных приема стабилизации:

- защита лабильных центров ферментов, ответственность за их активность, химической модификацией (в том числе иммобилизацией);

- защита от воздействия инактивирующих факторов нанесением оболочки;

- введением в субстанцию или лекарственную форму добавок,  ингибирующих деструкцию ферментов.

Термин «фермент» предложен в XVII веке химиком ван Гельмонтом при обсуждении механизмов пищеварения.

В конце XVIII – начале XIX вв. уже было известно, что мясо переваривается желудочным соком, а крахмал превращается в сахар под действием слюны. Однако механизм этих явлений был неизвестен.

В XIX в. Луи Пастер, изучая превращение углеводов в этиловый спирт под действием дрожжей, пришёл к выводу, что этот процесс брожения катализируется некой жизненной силой, находящейся в дрожжевых клетках.

 

 

Функции ферментов.

 

Ферменты присутствуют во всех живых клетках и способствуют превращению одних веществ (субстратов) в другие (продукты). Ферменты выступают в роли катализаторов практически во всех биохимических реакциях, протекающих в живых организмах. К настоящему времени было описано более 5000 разных ферментов. Они играют важнейшую роль во всех процессах жизнедеятельности, направляя и регулируя обмен веществ организма.

Подобно всем катализаторам, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакцию, понижая энергию активации процесса. Химическое равновесие при этом не смещается ни в прямую, ни в обратную сторону. Отличительной особенностью ферментов по сравнению с небелковыми катализаторами является их высокая специфичность – константа связывания некоторых субстратов с белком может достигать 10−10 моль/л и менее. Каждая молекула фермента способна выполнять от нескольких тысяч до нескольких миллионов «операций» в секунду.

Например, одна молекула фермента ренина, содержащегося в слизистой оболочке желудка телёнка, створаживает около 106 молекул казеиногена молока за 10 мин при температуре 37 °C.

При этом эффективность ферментов значительно выше эффективности небелковых катализаторов – ферменты ускоряют реакцию в миллионы и миллиарды раз, небелковые катализаторы – в сотни и тысячи раз.

 

 

Классификация ферментов.

 

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации. Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии. Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками.  Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом.

• Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа.
• Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.
• Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза.
• Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.
• Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.
• Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счёт гидролиза АТФ. Пример: ДНК-полимераза.

Будучи катализаторами, ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию – присоединение по двойным связям.

 

Специфичность ферментов.

Ферменты обычно проявляют высокую специфичность по отношению к своим субстратам (субстратная специфичность). Это достигается частичной комплементарностью формы, распределения зарядов и гидрофобных областей на молекуле субстрата и в центре связывания субстрата на ферменте. Ферменты обычно демонстрируют также высокий уровень стереоспецифичности (образуют в качестве продукта только один из возможных стереоизомеров или используют в качестве субстрата только один стереоизомер), региоселективности (образуют или разрывают химическую связь только в одном из возможных положений субстрата) и хемоселективности (катализируют только одну химическую реакцию из нескольких возможных для данных условий). Несмотря на общий высокий уровень специфичности, степень субстратной и реакционной специфичности ферментов может быть различной. Например, трипсин эндопептидаза разрывает пептидную связь только после аргинина или лизина, если за ними не следует пролин, а пепсин гораздо менее специфичен и может разрывать пептидную связь, следующую за многими аминокислотами.

 

Модель «ключ-замок»

В 1890 г. Эмиль Фишер предположил, что специфичность ферментов определяется точным соответствием формы фермента и субстрата. Такое предположение называется моделью «ключ-замок» (рис.1). Фермент соединяется с субстратом с образованием короткоживущего фермент-субстратного комплекса. Однако, хотя эта модель объясняет высокую специфичность ферментов, она не объясняет явления стабилизации переходного состояния, которое наблюдается на практике.

 

Рис. 1. Модель «ключ-замок»

 

Регуляция работы ферментов.

У некоторых ферментов есть места связывания малых молекул, они могут быть субстратами или продуктами метаболического пути, в который входит фермент. Они уменьшают или увеличивают активность фермента, что создает возможность для обратной связи.

 

Влияние условий среды на активность ферментов.

Активность ферментов зависит от условий в клетке или организме – давления, кислотности среды, температуры, концентрации растворённых солей (ионной силы раствора) и др.

 

Медицинское значение.

Связь между ферментами и наследственными болезнями обмена веществ была впервые установлена А. Гэрродом в 1910-е гг. Гэррод назвал заболевания, связанные с дефектами ферментов, «врожденными ошибками метаболизма».

Если происходит мутация в гене, кодирующем определенный фермент, может измениться аминокислотная последовательность фермента. При этом в результате большинства мутаций его каталитическая активность снижается или полностью пропадает. Если организм получает два таких мутантных гена (по одному от каждого из родителей), в организме перестает идти химическая реакция, которую катализирует данный фермент. Например, появление альбиносов связано с прекращением выработки фермента тирозиназы, отвечающего за одну из стадий синтеза темного пигмента меланина. Фенилкетонурия связана с пониженной или отсутствующей активностью фермента фенилаланин-4-гидроксилазы в печени.