Метод меченых атомов

Важная группа работ охватывает исследования механизмов химических реакций в организме. Так, во многих случаях удалось установить связь между исходными и вновь образующимися молекулами, проследить за «судьбой» отдельных атомов и химических групп в процессах обмена веществ, а также выяснить последовательность и скорость этих превращений. Полученные данные сыграли решающую роль при построении современных схем биосинтеза и метаболизма (метаболических карт), путей превращения пищи, лекарственных препаратов и ядов в живых организмах. К работам этой группы относится выяснение вопроса о происхождении кислорода, выделяемого в процессе фотосинтеза: оказалось, что его источником является вода, а не двуокись углерода. С другой стороны, применение ¹⁴CO₂ позволило выяснить пути превращений двуокиси углерода в процессе фотосинтеза. Использование «меченой» пищи привело к новому представлению о скоростях всасывания и распространения пищевых веществ, об их «судьбе» в организме и помогло проследить за влиянием внутренних и внешних факторов (голодание, асфиксия, переутомление и т. д.) на обмен веществ.

Метод изотопных индикаторов позволил изучить процессы обратимого транспорта веществ через биологические мембраны. Было показано, что концентрации веществ по обе стороны мембраны остаются постоянными с сохранением градиентов концентрации, характерных для каждой из разделённых мембранами сред.

Метод изотопных индикаторов нашёл применение в исследовании процессов, решающую роль в которых играет передача информации в организме (проводимость нервных импульсов, инициация и рецепция раздражения и др.) Эффективность метода изотопных индикаторов в работах этого рода обусловлена тем, что исследования проводятся на целостных, интактных организмах, сохраняющих неповрежденной всю сложную систему нервных и гуморальных связей. Наконец, группа работ включает исследования статических характеристик биологических структур, начиная с молекулярного уровня (белки, нуклеиновые кислоты) и кончая надмолекулярными структурами(рибосомы, хромосомы и др. органеллы). Например, исследования относительной устойчивости  белков  и нуклеиновых кислот в  ¹H₂O,  ²H₂O и в H₂¹⁸O способствовали выяснению природы сил, стабилизирующих структуру биополимеров, в частности роли водородных связей в биологических системах.

Важное значение при выборе изотопа имеет вопрос о чувствительности метода изотопного анализа, а также о типе радиоактивного распада и энергии излучения. Преимущество стабильных изотопов (²H, ¹⁸O, ¹⁵N и др.) — отсутствие излучений, часто оказывающих побочное воздействие на исследуемую живую систему. В то же время, сравнительно низкая чувствительность методов их определений (масс-спектроскопия, денситометрия), а также необходимость выделения меченого соединения ограничивают применение стабильных изотопов в биологии. Высокая чувствительность регистрации гамма-активных изотопов (⁵⁹Fe, ¹³¹I и др.) позволила в живом организмеизмерить скорость кроветока, определить количество крови и время её полного кругооборота, исследовать работу желёз внутренней секреции. С помощью изотопных индикаторов в медицине были раскрыты механизмы развития (патогенез) ряда заболеваний; их применяют также для изучения обмена веществ и диагностики многих заболеваний. Изотопные индикаторы вводят в организм в крайне малых количествах, не способных вызвать какие-либо патологические сдвиги. Различные элементы неравномерно распределяются в организме. Аналогично им распределяются и изотопные индикаторы. Излучение, возникающее при распаде изотопа, регистрируют радиометрическими приборами, сканированием, авторадиографией и др. Так, состояние большого и малого круга кровообращения, сердечного кровообращения, скорости кровотока, изображение полостей сердца определяют с помощью соединений, включающих ²⁴Na, ¹³¹I, ^99MTc; для изучения лёгочной вентиляции и заболеваний спинного мозга применяют ^99MTc, ¹³³Xe; макроагрегаты альбумина человеческой сыворотки с ¹³¹I используют для диагностики различных воспалительных процессов в легких, их опухолей и при различных заболеваниях щитовидной железы. Концентрационную и выделительную функции печени изучают при помощи краски бенгал-роз с ¹³¹I, ¹⁹⁸Au; функцию почек — при ренографии c ¹³¹I-гиппураном и сканированием после введения неогидрина, меченого ²⁰³Hg или ^99MTc. Изображение кишечника, желудка получают, используя ^99MTc, селезёнки — применяя эритроциты с ^99MTc или ⁵¹Сr; с помощью ⁷⁵Se диагностируют заболевания поджелудочной железы. Диагностическое применение имеют также ⁸⁵Sr и ⁸⁵P.

Изотопные индикаторы в сельском хозяйстве (³H, ¹⁴C, ²²Na, ³²P, ³⁵S, ⁴²K, ⁴⁵Ca, ⁶⁰Co, ⁶⁵Zn, ⁹⁹Mo и др.) широко используются для определения физических свойств почвы и запасов в ней элементов пищи растений, для изучения взаимодействия почвы и удобрений, процессов усвоения растениями питательных элементов из минеральных туков, поступления в растения минеральной пищи через листья и других вопросов почвоведения и агрохимии. Пользуются изотопными индикаторами для выявления действия на растительный организм пестицидов, в частности гербицидов, что позволяет установить концентрацию и сроки обработки ими посевов. Применяя метод изотопных индикаторов, исследуют важнейшие биологические свойства с.-х. культур (при оценке и отборе селекционного материала) — урожайность, скороспелость, хладостойкость. В животноводстве изучают физиологические процессы, протекающие в организме животных, проводят анализ кормов на содержание токсичных веществ (малые дозы которых трудно определить химическими методами) и микроэлементов. При помощи изотопных индикаторов разрабатывают приёмы автоматизации производственных процессов, например отделение корнеклубнеплодов от камней и комков почвы при уборке комбайном на каменистых и тяжёлых почвах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Авторадиография

 

 

Основное назначение авторадиографии - регистрация полос радиоактивно меченых препаратов (белков и НК) после электрофореза. Для этой цели используют медицинскую "неэкранированную" рентгеновскую пленку (в пленках  с защитным слоем на поверхности  поглощается часть излучения). Почернение рентгеновской пленки (после проявления) происходит как под действием  электронов, так и у-излучения. Препараты, меченые тритием, ввиду малой проникающей способности его (3-электронов, лишь в случае очень высоких интенсивностей излучения удается регистрировать данным методом. Авторадиография препаратов, меченых S и С осуществляется вполне успешно. Однако пластинки ПААГ в этих случаях необходимо перед регистрацией радиоактивности полностью высушивать. В противном случае Р-электроны, испускаемые в глубине геля, не достигнут пленки. Сушат гель, уложив его на толстую фильтровальную бумагу (он прилипает и при сушке не съеживается), 1-2 часа в вакууме и с нагреванием или 36 часов на воздухе при комнатной температуре - до состояния тонкой, прочной и прозрачной пленки. Тем не менее, нежелательно, чтобы толщина влажного геля превышала 0,4 мм. Рентгеновскую пленку накладывают эмульсией прямо на гель. В такой постановке опыта Р-электроны углерода и серы проникают в слой эмульсии на глубину около 0,25 мм. Для хорошего прилегания пленки к гелю под крышку соответствующей кассеты с пружинными зажимами кладут прокладку из губчатой резины. Саму кассету заворачивают в черную бумагу. Экспозиция длится несколько дней. Затем следует, как обычно, проявление и фиксация.

Энергия Р-излучения радиоактивного фосфора достаточно велика, чтобы  его авторадиографию можно было вести прямо с влажной пластины геля. Гель, покрытый пленкой, оставляют  на одной из стеклянных пластин, заворачивают в тонкий полиэтилен и экспонируют, как было описано выше, в течение  нескольких часов - лучше на холоде (-20°), с тем, чтобы помешать расплыванию  полос в геле во время экспозиции за счет диффузии. Р-электроны радиоактивного фосфора могут проходить в  материале рентгеновской пленки до глубины в 6 мм. Это означает, что  большая часть их "прошивает" пленку, не передав всю свою энергию  молекулам бромистого серебра и, следовательно, не самым лучшим образом  регистрируются. Иногда, если интенсивность  Р-излучения невелика (за малостью содержания), эти "пропадающие зря" электроны  улавливают с помощью фосфоресцирующего  экрана, который устанавливают по другую сторону пленки. Попавшие на экран Р-электроны вызывают его  свечение и пленка регистрирует (не без некоторого размытия изображения) еще и светящуюся полосу на экране. Зато яркость почернения в этом случае может увеличиться в 5-8 раз.

Поскольку при использовании  флюоресценции экрана возможна релаксация кристаллов бромистого серебра, распавшихся  под действием света, экспозицию пленки лучше проводить в этом случае при - 70°. Для правильного совмещения пленки после проявления с исходным гелем, на нем до авторадиографии делают две пометки по углам радиоактивными чернилами.

 

 

2.1  Преимущества и недостатки авторадиографии

 

 

Авторадиография весьма популярный метод детекции различных нуклеотидов. Но как и у любого метода у неё тоже существуют свои преимущества и недостатки.

Главное преимущество авторадиографии  — простота и доступность. Выдержите (проэкспонируйте) образец с рентгеновской  пленкой, затем проявите пленку в  стандартных условиях — и получите картину распределения радионуклида по поверхности образца: геля, тонкослойной хроматограммы и т.д. Если полученная "картинка" вас не устраивает — можно повторить экспозицию с новой пленкой, увеличивая (или уменьшая) время по своему желанию. Обычно время экспозиции меняют в 2÷3 раза, так как изменение времени экспозиции на 20÷30% существенных изменений в картину не вносит. Весь сиквенс ДНК и РНК с радиоактивным фосфором использовал исключительно авторадиографию. Флюоресцентная метка практически полностью вытеснила радиоактивные изотопы из секвенирования, однако авторадиография остается широко применяемым методом детекции.

Главный недостаток авторадиографии  — сложности с количественной оценкой. При визуальном определении  даже интуитивно ясно, что интенсивность "почернения" пленки пропорциональна  количеству радиоактивных атомов в  этом месте. Но вопрос об этой "пропорциональности" нуждается в пояснении. Существует несколько типов сканеров, позволяющих  довольно точно определять интенсивность "зачернения" пленки и, следовательно, сравнивать пятна инструментально, а не "на глаз". Оказалось, что диапазон активности препарата, в котором интенсивность "зачернения" пленки прямо пропорциональна количеству радиоактивных атомов, очень невелик и зависит от времени экспозиции образца с пленкой, типа пленки, природы радионуклида (тип распада и энергия излучения) и даже от режима обработки пленки. Например, для фосфора-32 за ночь экспозиции линейная зависимость "зачернения" пленки от активности образца находится в диапазоне 0,5÷25 Бк на мм² (примерно 30÷1500 имп/мин). Дальнейшее увеличение активности образца, например, до 100 Бк на мм² не приводит к большей интенсивности "зачернения" — всё уже "зашкалило".

Поэтому, простой совет  для начинающих работать с количественной авторадиографией. Сделайте несколько  калибровок — нанесите ряд пятен  диаметром 1÷1,5 мм с активностью 1 · 3 · 10 · 30 · 100 · 300 Бк, проэкспонируйте их с рентгеновской пленкой различное время и после обработки пленки просканируйте её на своем приборе. Вы сразу определите диапазон, в котором ваши последующие количественные измерения радиоавтографов будут корректными. Для разных радионуклидов такой диапазон различается очень существенно, но учитывать его надо в любом случае.

Для увеличения чувствительности авторадиографии (точнее, для уменьшения времени экспозиции) можно воспользоваться  усиливающими экранами. Это весьма эффективно для фосфора-32 или йода-125, однако практически бесполезно для  мягких (слабоэнергетических) β-излучателей. Использование экрана для фосфора-32 позволяет снизить время экспозиции в 2÷3 раза, но за это приходится "платить" ухудшением разрешения, которое происходит за счет "размывания зон".

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 Сцинтилляционные счетчики

 

 

Эффект сцинтилляции для  количественного определения радионуклидов  начинали использовать еще во времена  Резерфорда, который визуально считал сцинтилляционные вспышки под микроскопом. За сто лет принципиальных изменений  не произошло. Рядом с источником излучения помещают сцинтиллятор и  ФЭУ (фотоэлектронный умножитель), который  считает вспышки. Сцинтиллятор может  быть твердым, а может быть и жидким (чаще, растворенным в жидкости). Во флакон (vial) с жидким сцинтиллятором добавляют тестируемый образец, и в этом случае можно эффективно измерять даже самое "слабое", низкоэнергетическое излучение.

При измерении активности (радиоактивности) любых образцов и  для любых средств измерения  необходимо помнить несколько простых, но важных правил:

Радиоактивный распад является классическим примером случайного, вероятностного природного процесса и, рассматривая измерение  активности как регистрацию случайных  событий, мы получаем математическую ошибку измерения активности:

n^1/2/n x 100%

где n — число "событий" (в нашем случае распадов).

Например, для 400 зарегистрированных импульсов на любом приборе независимо от времени измерения (наблюдения) 400^1/2 / 400 х 100% = 5%, т.е. ошибка 5%. Это означает, что чем больше число измерений (собственно счет), тем меньше математическая ошибка измерения. Более того, вопреки устоявшейся традиции, для снижения математической ошибки измерения надо считать не число зарегистрированных прибором распадов (импульсов) за единицу времени, а время, необходимое для "накопления нужного" числа импульсов — например, 10000 имп. Тем не менее, во всем мире активность с помощью счетчиков измеряют как количество импульсов за единицу времени (обычно по 1 минуте).

Все счетчики имеют верхний  предел измерения, после которого их точность падает, так как счетчик  не успевает регистрировать — "захлебывается". Для сцинтилляционных счетчиков  — это активность на уровне 10⁶÷10⁷ расп./мин. Некоторые типы счетчиков имеют встроенную блокировку и отказываются считать образцы, активность которых превышает установленную для данной модели. Оптимальная активность образца для точного измерения 10⁴÷10⁶ расп./мин.

Проводя количественные измерения, например, определяя концентрацию радионуклида в растворе, всегда делайте хотя бы 2, а лучше 3 измерения независимых  аликвот и активность определяйте как среднюю из 2 — 3 измерений. Затраты времени на "лишние" процедуры будут с лихвой компенсированы отсечением случайных "выбросов". Разброс в измерениях, особенно у начинающих исследователей, может достигать 200% и более, хотя в норме не должен превышать обычную ошибку рутинного отбора аликвот.

Ни один измерительный  прибор не регистрирует 100% всех "распадов" (decompositions) в измеряемом образце. Эффективность счета — это коэффициент, который связывает зарегистрированные прибором импульсы (counts) и реальные распады (decompositions). Поэтому для любого измерения распады/мин. (dpm — decompositions per min.) больше импульсов/мин. (cpm — counts per min.). Правда, для большинства радионуклидов, применяемых в life science, эффективность жидкостного сцинтилляционного счета составляет более 90%. Однако, тритий удается измерять с эффективность не более 50÷60%. Обычно эффективность счета для каждого радионуклида указывается в технической документации к прибору, и долгое время негласное соревнование между фирмами за более высокую эффективность счета трития было чуть ли не главным двигателем технического прогресса в этой области.

Все измерительные приборы  имеют собственный "фон" — регистрируют какое-то количество импульсов без  источника ионизирующего излучения (радиоактивного препарата). Природа  фона различна: космическое излучение, электронный шум, содержание природных  радионуклидов в помещении, где  установлена измерительная аппаратура и т.д. Поэтому минимально достоверная величина активности, измеряемая прибором, увязывается с фоном и обычно принимается равной трехкратному превышению фона данного прибора. Если в вашем "эпохальном" эксперименте активность "главного" образца едва-едва превышает фон, попытайтесь увеличить время измерения (можно до 20 мин.) — тогда достоверность измерения возрастёт.

В большинстве случаев  в life science абсолютные измерения активности не нужны, и гораздо важнее получить информацию об относительной активности образцов: распределение активности по гелю, хроматографической пластинке или по элюированным с колонки продуктам; доля субстрата, превратившегося в продукт под действием фермента; доля лиганда, связанного с рецептором; детекция продуктов метаболизма соединения, меченного радионуклидом, и другие аналогичные задачи. Поэтому очень важно, чтобы условия приготовления и измерения образцов в конкретном эксперименте были одинаковыми, тогда абсолютные погрешности в измерениях не окажут существенного влияния на биологические результаты.