Неспецифические методы лабораторной диагностики туберкулеза

4. Иммунологические методы

4.1. Туберкулинодиагностика

Туберкулинодиагностика используется при первичной диагностике туберкулеза и оценке активности процесса, представляет собой определение реакции организма на внутрикожное введение туберкулина. Основным методом диагностики туберкулеза у детей является массовая туберкулинодиагностика, что обеспечивает выявление преимущественно ограниченных форм туберкулеза. Среди всех, впервые взятых на учет, ежегодно не менее 77% больных детей выявляется с помощью туберкулиновых проб. Применение туберкулиновых проб у взрослых в качестве скрининга нецелесообразно, т.к. до 80% взрослого населения инфицировано микобактериями туберкулеза.

Туберкулин - препарат, приготовленный из культуры микобактерий туберкулеза (протеиновая фракция) и обладающий их антигенными свойствами. В инфицированном организме при нормальной (или повышенной) иммунологической реактивности в ответ на введение антигенов микобактерий туберкулеза развивается реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Виды туберкулина

Aльттуберкулин Коха (AТК), или старый туберкулин Коха, представляет собой автоклавированный фильтрат 6-9 недельной культуры M.tuberculosis.

На смену AТК пришли очищенные стандартные препараты туберкулина Зейберта - РРD-3 (Purified Protein Derivative - очищенный белковый дериват) и М. А. Линниковой - РРD-Л. Названные препараты освобождены от белковых составляющих питательной среды, что увеличивает специфичность реакции организма на туберкулин. На практике применяют стандартные растворы РРD-Л, содержащие 2 ТЕ (для массовых обследований).

Метод туберкулинодиагностики

Принятым методом проведения туберкулинодиагностики для массового обследования населения и в практике противотуберкулезных учреждений в России является внутрикожная проба Манту.

Порядок проведения пробы Манту:

• обрабатывают кожу средней трети внутренней поверхности предплечья ватным тампоном с 70% спиртом,
• в туберкулиновый (1 мл) шприц набирают 0,2 мл стандартного раствора РРD-Л,
• через инъекционную иглу в вертикальном положении из шприца выпускают пузырьки воздуха с 0,1 мл РРD-Л,
• вводят в кожу иглу срезом вверх, при этом положение шприца должно быть максимально параллельным поверхности предплечья,
• место инъекции повторно спиртом не обрабатывают (РРD-Л содержит антисептик),
• учет реакции - наличие папулы и гиперемии: измерение диаметра папулы (наибольшего в случае появления клеточного инфильтрата в форме неправильном окружности) проводят прозрачной линейкой через 48-72 ч.

Результат внутрикожной туберкулиновой пробы оценивается как отрицательный (анергическая реакция), либо как положительный, который в свою очередь оценивается как нормергическая или гиперергическая реакция.

В медицинской документации при регистрации результатов пробы Манту папула сокращенно обозначается буквой "п", гиперемия - буквой "г". Например, папула размером 5 мм обозначается "п - 5 мм".

Отрицательная реакция (туберкулиновая анергия), как правило, свидетельствует об отсутствии иммунитета к микобактериям туберкулеза, она наблюдается у людей, не контактировавших с М. tuberculosis, и у больных с тяжелой прогрессирующей формой туберкулеза, иммунитет которых не сформировался или подавлен в условиях ослабленного, истощенного организма на фоне злокачественных новообразований, приема иммунодепрессантов, инфекционных и других заболеваний и состояний, приводящих к иммунодефициту. Вирусные гепатиты, корь, коклюш, скарлатина, малярия, саркоидоз, микседема, белковое голодание, прием цитостатиков и глюкокортикондов вызывают у больных туберкулезом снижение или полное отсутствие реактивности к туберкулину. В ряде случаев в результате успешно проводимой терапии туберкулеза и сопутствующего заболевания или отмены иммунодепрессантов реактивность у таких больных восстанавливается.

Необходимо иметь ввиду, что отрицательная кожная проба Манту не всегда отражает отсутствие иммунитета, так как при этом могут быть выявлены диагностически значимый титр антимикобактериальных антител и/или положительные клеточные реакции. Наличие ложноотрицательных результатов туберкулиновой внутрикожной пробы связано с нарушениями правил и порядка выполнения исследования. Определить ложность отрицательного результата можно только при проверке срока годности препарата туберкулина (истекший) или знаний медицинского персонала о технике выполнения пробы. В случае выявления ложноотрицательного результата речь не может идти о туберкулиновой анергии. Туберкулинодиагностику следует провести повторно с соблюдением всех правил метода.

Антигенные характеристики туберкулина разных серий и от разных производителен могут быть несхожими настолько, что реактивность к ним у одного и того же больного может существенно различаться. Данное обстоятельство необходимо иметь и виду при сравнении результатов туберкулиновой пробы, полученных в разных учреждениях. Вместе с тем указанное антигенное различие туберкулиновых препаратов может быть полезно при проверке отрицательной реакции пробы Манту (туберкулиновой анергии). Применив препараты нескольких серий, можно выявить реактивность на один из них, хотя такой результат потребует проверки на специфичность методом повторения пробы в короткие сроки (см. ниже).

Положительная нормергическая реакция наблюдается либо вследствие иммунизации вакциной БЦЖ, либо в результате естественного инфицирования М.tuberculosis с последующим формированием иммунитета, предупреждающим развитие туберкулезного процесса.

Гиперергическая реакция, как правило, свидетельствует о заболевании туберкулезом. Перекрестная реакция на туберкулин вследствие гиперсенсибилизации организма непатогенными микобактериями окружающей среды редко наблюдается в северных широтах.

Результаты пробы Манту имеют особую диагностическую значимость при оценке реакции в динамике, поэтому туберкулинодиагностика детям и подросткам должна проводиться ежегодно. Переход отрицательной туберкулиновой пробы в положительную или увеличение размера папулы по сравнению с предыдущим результатом на 6 мм и более называется виражом туберкулиновой чувствительности. При этом конверсия отрицательной реакции в положительную свидетельствует о факте ннфицирования человека М.tuberculosis и формировании у него нестерильного клеточного иммунитета; вираж в виде указанного увеличения диаметра папулы - о реактивации туберкулезного процесса.

Проверку специфичности положительной реакции туберкулиновой пробы рекомендуется проводить повторением пробы в короткие сроки - через 1-2 нед после первой. Специфическая реакция организма на туберкулин, в отличие от неспецифическоп, сопровождается бустерным эффектом, выражающимся нарастанием реактивных проявлений.

Реакция на введение туберкулина не ограничивается проявлениями со стороны лимфатической системы и кожи. В теменне 0,5-2 ч после инъекции туберкулина у части больных в периферической крови происходит уменьшение количества эозинофилов. При снижении содержания эозинофилов более чем на 10% (для детей 5%), но не менее чем на 30 эозинофилов в 1 мкл крови, реакция считается положительной (проба Ф. Л. Михайлова).

Туберкулиново-эозинофильная проба Михайлова дает до 70% и более положительных ответов у лиц с активными формами туберкулеза. Вместе с тем положительная реакция отмечается и в случаях нетуберкулезной патологии, при ревматизме, тонзиллите, тиреоидитах.

Другие показатели гемограммы также изменяются при введении туберкулина. Наблюдается падение (или увеличение) содержания лимфоцитов, увеличение содержания нейтрофилов с увеличением доли палочкоядерных клеток. Может повышаться содержание моноцитов и общее количество лейкоцитов. Отмечается увеличение СОЭ.

4.2. Методы определения специфических антител к микобактериям туберкулеза (анти-МБТ)

Методы определения специфических антител к микобактериям тубекулеза (анти-МБТ) в литературе иногда называются серологическими методами, однако, это не является правильным термином, так как при лабораторной диагностике туберкулеза антитела могут выявляться не только в сыворотке крови (serum), но и в тканях пораженных органов. Термин "противотуберкулезные антитела" также не совсем корректен, как, например, выражение "противогепатитные антитела" (то есть не может быть антител против болезни, они существуют против патогенов). Методами ИФА, РСК, РНГА определяют иммуноглобулины класса IgG, специфичные к антигенам микобактерии туберкулеза. Самым современным способом определения специфических антимикобактериальных антител является иммуноферментпый анализ (ИФА), отличающийся от прежних методик большей стандартизацией реагентов и условий проведения исследования. Усилиями Санкт-Петербургского НИИ фтизиатрии (СПбНИИФ) и Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии (СПбНИИЭМ) им. Пастера была разработана стандартная иммуноферментная тест-система для обнаружения антител к возбудителю туберкулеза.

Выявление специфических анти-МБТ антител методом ИФА не может быть эффективно использовано при скрининге туберкулеза, как, например, при скриннинге ВИЧ-инфекции выявление антител к ВИЧ, в силу его недостаточной чувствительности и специфичности. Число ложноположительных результатов, получаемых при использовании отечественных и зарубежных тест-систем, составляет от 5 до 10%. При этом у больных туберкулезом положительные результаты исследования регистрируются только в 45-70%. Однако в случаях, когда проведение бактериологических, рентгенологических и гистологических исследований не дает желаемого эффекта, информативны методы иммунологической диагностики туберкулеза, направленные на выявление изменений иммунного статуса больного, типичных для специфического процесса.

Обнаружение в периферической крови специфических антимикобактериальных антител (в диагностических титрах), независимо от выраженности специфического клеточного ответа, является одним из характерных, диагностически значимых признаков туберкулеза. Вместе с тем, необходимо иметь в виду, что отсутствие в крови специфических антнмикобактериальных антител не является основанием для исключения диагноза туберкулеза, особенно в случаях специфического процесса внелегочной локализации.

По данным СПбНИИФ, в результате комплексного определения специфических антимикобактериальных антител удается выявить серопозитивность у 80-98% наиболее тяжелых больных туберкулезом легких, позвоночника, почек, у 40-60% - больных туберкулезом женских гениталий, глаз, периферических лимфоузлов, туберкулезпо-аллергическими синовитами.

В патологических очагах в органах и тканях местный иммунный ответ наиболее выражен, поэтому целесообразным является поиск антимикобактериальных антител (иногда с применением провокационных туберкулиновых проб) в биологических жидкостях или экстрактах тканей из анатомических зон поражения или максимально приближенных к ним участков (табл. 19.3).

При поражениях глаз и в случаях, когда работа с указанными биологическими жидкостями оказывается нецелесообразной или невозможной, существенную помощь в иммунодиагностике туберкулеза оказывает углубленное изучение клеточных реакций, характеризующих специфическую сенсибилизацию В- и Т-лимфоцитов, особенно на фоне пробы Коха.

4.3. Комплексная иммунодиагностика туберкулеза

Специалистами СПбНИИФ и СПбНИИЭМ им. Пастера предложен способ иммунодиагностики туберкулеза различных локализаций, осуществляемый с помощью стандартизованного многоуровневого алгоритма - обнаружение анти-МБТ в сыворотке крови методом ИФА, которое при необходимости может быть дополнено выявлением анти-МБТ методом ИФА в биологических жидкостях (экстрактах тканей) из очагов поражения, определением специфической сенсибилизации В- и Т-лимфоцитов, изучением динамики специфического антителообразования на системном и (или) местном уровне на фоне пробы Коха.

1-й уровень. Поиски анти-МБТ в сыворотке крови с помощью ИФА или комплекса методов (что дает лучшие результаты) - ИФА и реакций непрямой гемагглютинации (РНГА), потребления комплемента (РПК) и пассивного гемолиза (РПГ) с туберкулином - у всех больных с подозрением им туберкулез в момент обследования. При наличии веских анамнестических, клинических, рентгенологических и лабораторных данных в пользу туберкулезной этиологии заболевании достаточно обнаружить апти-МБТ в 1-2 реакциях, не прибегая к дальнейшим иммунодиагностическим мероприятиям.

2-й уровень. Поиски анти-МБТ в крови на фоне пробы Коха (до и через 48 ч после подкожного введения туберкулина) у больных с подозрением на туберкулез глаз, женских гениталий, периферических лимфоузлов, синовиальной оболочки - при отсутствии четких клинико-рентгено-лабораторных признаков и серологических данных, полученных на 1-м уровне. Увеличение титров анти-МБТ на фоне пробы Коха с учетом уколочной, очаговой и общей реакции организма, учитываемых клиницистами, следует расценивать как доказательство туберкулезной природы заболевания.

3-й уровень. Выявление анти-МБТ в биологических жидкостях (экстрактах из тканей) из анатомической зоны поражения - преимущественно методом ИФА - для уточнения диагноза у больных синовитами, лимфаденитами, сальпингоофоритами, спондилитами с неврологическими осложнениями при отсутствии убедительных клинико-рентгено-лабораторных данных и неясных результатах, полученных на 1-м и 2-м уровнях, а также при наличии противопоказаний для проведения пробы Коха.

Выявление динамики титров анти-МБТ в жидкости бронхоальвеолярного лаважа на фоне пробы Коха информативно для уточнения диагностики ограниченных поражений легких.

4-й уровень. Изучение специфической пролиферации сенсибилизированных Т-лимфоцитов в реакции бластной трансформации (РБТЛ) с туберкулином у лиц с отсутствием бесспорных клинико-рентгено-лабораторных признаков, сочетающихся с нечеткими серологическими данными 1, 2, 3 уровней, а также при наличии противопоказаний для постановки пробы Коха и при наличии противопоказаний, либо полной невозможности получить материал для серологического исследования непосредственно из очага поражения. Последнее обстоятельство типично для заболевания глаз.

Выявление анти-МБТ в сыворотке крови в диагностически значимых титрах зависит от локализации, формы и фазы специфического процесса. В целом, чувствительность комплекса серологических методов составляет от 50 до 100%, специфичность - 89%, что, как правило, превышает информативность любой отдельно взятой реакции, включая ИФА. При проведении дифференциальной диагностики между туберкулезом и неспецифическими воспалительными заболеваниями тех же локализаций специфичность комплекса серологических методов колеблется от 77% (неспецифические увеиты) и 82% (неспецифические аднекситы) до 88-90% (заболевания легких, позвоночника, почек).