Новейшие достижения в трансплантологии

г. Основной недостаток методов, основанных на применении смешанной культуры лимфоцитов, — большие затраты времени (около недели). Для более быстрого получения результатов отвечающие клетки в смешанной культуре лимфоцитов предварительно активируют известными антигенами HLA класса II. Для этого необходима панель лимфоцитов с разными антигенами HLA класса II. Кроме того, методы, основанные на применении смешанной культуры лимфоцитов, плохо воспроизводимы, поэтому, если необходимо выбрать одного из нескольких доноров, смешанные культуры с лимфоцитами, полученными от всех доноров, готовят одновременно. Если используются гомозиготные стимулирующие клетки, они должны быть выделены непосредственно перед исследованием. Уже отмечалось, что доноров гомозиготных клеток очень мало, поэтому исследования с использованием этих клеток проводятся только в специализированных лабораториях. С помощью реакции клеточной цитотоксичности предсказать отторжение трансплантата можно далеко не во всех случаях, поэтому метод не получил широкого распространения.

Б. Выявление сенсибилизации реципиента антигенами HLA

1. Определение антител к антигенам HLA. Антитела к антигенам HLA появляются после контакта клеток иммунной системы с этими антигенами, например во время беременности. Присутствие в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора служит противопоказанием к трансплантации органа, полученного от данного донора. Определение антител к антигенам HLA в сыворотке больного, которому планируется трансплантация органа, проводят при первичном обращении к врачу, а также во всех случаях, когда возможен контакт с антигенами HLA: после переливания компонентов крови, трансплантации органов или во время беременности. Для выявления антител к антигенам HLA используют 30—60 образцов лимфоцитов, типированных по наиболее распространенным антигенам HLA. Исследование проводят с помощью лимфоцитотоксического теста. Результат выражают в виде коэффициента серопозитивности. Он представляет собой отношение числа образцов лимфоцитов, вызывающих положительную реакцию, к общему числу образцов в панели, выраженное в процентах. Коэффициент серопозитивности отражает риск сверхострого отторжения трансплантата, взятого от случайного донора. Чем этот коэффициент выше, тем сложнее подобрать совместимого донора. Если коэффициент серопозитивности превышает 80%, трансплантация возможна только от донора, полностью совместимого с реципиентом по антигенам HLA.

2. Для определения специфичности антител необходимо знать антигены HLA клеток, которые вызвали положительную реакцию в лимфоцитотоксическом тесте. Например, если в панели имеется 5 образцов лимфоцитов, несущих антиген HLA-A1, и со всеми ними отмечена положительная реакция, то сыворотка реципиента содержит антитела к антигену HLA-A1. Антитела могут взаимодействовать с разными антигенами HLA, образующими перекрестнореагирующие группы. У больных, сыворотка которых содержит антитела к антигенам одной или нескольких таких групп, обычно бывает высоким коэффициент серопозитивности.

3. С помощью серологических методов в сыворотке реципиента можно выявить следующие антитела.

а. Антитела к антигенам HLA класса I: HLA-A, HLA-B и HLA-C. Эти антигены присутствуют на поверхности лимфоцитов и моноцитов.

б. Антитела к антигенам HLA класса II: HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP. Эти антигены присутствуют на поверхности моноцитов и B-лимфоцитов. На поверхности покоящихся T-лимфоцитов они отсутствуют.

В. Проба на индивидуальную совместимость

1. Завершающий этап подбора донора — проведение пробы на индивидуальную совместимость. В основе пробы на индивидуальную совместимость лежит лимфоцитотоксический тест. Для этого к лимфоцитам донора добавляют сыворотку реципиента. Цель исследования — выявить любые антитела, которые могут реагировать с антигенами HLA донора и вызвать сверхострое отторжение трансплантата. Сверхострое отторжение обусловлено взаимодействием антител с антигенами HLA донора, находящимися на эндотелии трансплантата. Образовавшиеся комплексы активируют комплемент, который повреждает эндотелий и тромбоциты, приводя к тромбозу сосудов трансплантата. Положительный лимфоцитотоксический тест свидетельствует о высоком риске не только сверхострого, но и острого и хронического отторжения трансплантата. Острое отторжение обусловлено образованием антител, хроническое — появлением цитотоксических T-лимфоцитов, направленных против антигенов донора. Сыворотка реципиента для проведения пробы на индивидуальную совместимость должна быть получена не более чем за 1 мес до исследования. Дополнительно можно исследовать более ранние пробы сыворотки — иногда это позволяет выявить антитела, которые присутствовали в сыворотке реципиента в низком титре, а к моменту последнего забора крови исчезли. В этом случае обычно исследуют пробу сыворотки, содержащей наибольшее количество антител к разным антигенам HLA. Единого мнения о целесообразности исследования сывороток, полученных более чем за 6 мес до проведения пробы, нет. Считается, что оно необходимо, если у реципиента ранее обнаруживались антитела ко многим антигенам HLA или в прошлом он уже перенес трансплантацию. При этом обычно исследуют 2—6 проб сыворотки. Ложноположительные результаты лимфоцитотоксического теста возможны при наличии в сыворотке реципиента аутоантител, перекрестнореагирующих с лимфоцитами донора. Присутствие аутоантител подтверждается при смешивании сыворотки реципиента с его собственными лимфоцитами. Аутоантитела не повышают риск отторжения трансплантата.

2. Для выявления в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA донора дополнительно проводят следующие исследования.

а. Сыворотку реципиента смешивают с суспензией лимфоцитов и моноцитов донора и добавляют комплемент. Для повышения чувствительности исследования увеличивают время инкубации. Поскольку в суспензии содержится около 70% T-лимфоцитов и 30% B-лимфоцитов и моноцитов, положительный результат данного исследования свидетельствует о том, что в сыворотке реципиента присутствуют антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II.

б. Лимфоцитотоксический тест с T-лимфоцитами позволяет выявить только антитела к антигенам HLA класса I. Поскольку выделить из крови T-лимфоциты относительно просто, это исследование широко распространено. Если в сыворотке реципиента обнаруживаются IgG к T-лимфоцитам, трансплантация от этого донора абсолютно противопоказана.

в. Лимфоцитотоксический тест с B-лимфоцитами позволяет выявить антитела к антигенам HLA как класса I, так и класса II, поскольку B-лимфоциты несут на своей поверхности антигены обоих классов. Лимфоцитотоксический тест с B-лимфоцитами более информативен, чем с T-лимфоцитами, поскольку на поверхности B-лимфоцитов больше антигенов класса I. Исследование часто проводят с разными разведениями сыворотки реципиента. Это позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Если он превышает 1:4, то высок риск сверхострого отторжения трансплантата.

г. Проточная цитофлюориметрия также позволяет определить титр антител к антигенам HLA донора. Метод заключается в следующем. Лимфоциты донора инкубируют с сывороткой реципиента, после чего к смеси добавляют меченные флюоресцентной меткой антитела к иммуноглобулинам человека. Присутствующие в сыворотке донора антитела связываются с лимфоцитами, а затем — с мечеными антителами. Результат исследования выражают в виде гистограммы. По оси абсцисс откладывают интенсивность флюоресценции, по оси ординат — число флюоресцирующих клеток. Использование моноклональных антител к уникальным антигенам клеток, например CD3 T-лимфоцитов или CD20 B-лимфоцитов, позволяет исследовать отдельные популяции клеток. Чтобы отличить эти антитела от антител к иммуноглобулинам человека, их метят разными флюоресцентными метками. Например, чтобы выявить антитела к антигенам HLA класса I, связавшиеся только с T-лимфоцитами, суспензию лимфоцитов и моноцитов донора смешивают с сывороткой реципиента, затем добавляют антитела к человеческим IgG, меченные флюоресцеином (зеленое свечение), и моноклональные антитела к CD3, меченные фикоэритрином (красное свечение). Таким образом, T-лимфоциты, несущие исследуемые антигены HLA класса I, одновременно испускают красное и зеленое свечение. Чувствительность проточной цитофлюориметрии примерно в 100 раз превышает чувствительность серологических методов. Однако высокая чувствительность приводит к тому, что помимо антител к антигенам HLA выявляется множество других антител сыворотки реципиента, реагирующих с лимфоцитами донора, например аутоантител. В связи с этим положительный результат проточной цитофлюориметрии при определении антител к антигенам HLA требует дополнительных исследований.

д. Исследование с дитиотреитом и дитиоэритритом. Считается, что основную роль в отторжении трансплантата играют IgG, а неIgM. IgM часто (хотя не всегда) являются аутоантителами, направленными к антигенам, не относящимся к HLA. IgM вызывают отторжение трансплантата крайне редко (в большинстве лабораторий IgM к антигенам HLA не определяют). IgM связывают комплемент, что обуславливает положительный лимфоцитотоксический тест. Для инактивации IgM используют дитиотреит или дитиоэритрит, они разрушают дисульфидные связи между мономерами в пентамерной молекуле IgM. Если при исследовании антител к антигенам HLA в сыворотке, обработанной дитиотреитом или дитиоэритритом, получен отрицательный результат, то в ней отсутствуют IgG, которые могли бы вызвать отторжение.

е. Проба на индивидуальную совместимость при высоком и низком риске отторжения трансплантата. К группе больных с высоким риском отторжения трансплантата относятся реципиенты, ранее иммунизированные антигенами HLA (коэффициент серопозитивности превышает 15%, см. гл. 17, п. II.Б.1), и реципиенты, ранее перенесшие трансплантацию, независимо от коэффициента серопозитивности в данный момент. Следует помнить, что отсутствие антител к антигенам HLA в сыворотке реципиента не исключает его иммунизации этими антигенами. В этом случае после трансплантации органа активируются клетки памяти и синтез антител возобновляется. В связи с этим при высоком риске отторжения перед трансплантацией исследуются несколько проб сыворотки реципиента, полученных в разные периоды времени. Больным с высоким риском отторжения трансплантата обычно проводят лимфоцитотоксические тесты с T- и B-лимфоцитами и проточную цитофлюориметрию с использованием нескольких проб сыворотки. К группе больных с низким риском отторжения трансплантата относят реципиентов, которым трансплантацию проводят впервые, а также реципиентов, в сыворотке которых нет антител к антигенам HLA или они присутствуют в низком титре.

ж. Оценка пробы на индивидуальную совместимость.

1) У всех реципиентов исключают наличие аутоантител, поскольку они обуславливают ложноположительную пробу на индивидуальную совместимость. При выявлении аутоантител их инактивируют дитиотреитом или удаляют абсорбцией на лимфоцитах реципиента или другого человека и только после этого повторно проводят пробу.

2) Если в сыворотке реципиента обнаружены IgG к T-лимфоцитам донора, трансплантацию органа, полученного от данного донора, не проводят.

3) При положительном результате лимфоцитотоксического теста с B-лимфоцитами необходимы дополнительные исследования для определения класса антигенов HLA, против которых направлены антитела реципиента. В этом случае обычно проводят проточную цитофлюориметрию с T-лимфоцитами. Положительный результат этого исследования свидетельствует о том, что сыворотка реципиента содержит антитела к антигенам HLA класса I. Отрицательный результат проточной цитофлюориметрии с T-лимфоцитами указывает на присутствие в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II. Единого мнения о том, допустима ли трансплантация органов при наличии в сыворотке реципиента антител к антигенам HLA класса II, в настоящий момент нет. Однако у реципиентов с низким риском отторжения трансплантата и низким титром данных антител трансплантация обычно проходит успешно.

4) Если при положительном результате проточной цитофлюориметрии с T-лимфоцитами донора результаты лимфоцитотоксического теста с сывороткой реципиента и лимфоцитами донора отрицательны, результаты исследования оценивают с учетом того, к какой группе риска относится реципиент. Так, если реципиент относится к группе риска отторжения трансплантата, положительный результат проточной цитофлюориметрии служит противопоказанием к трансплантации органа, полученного от данного донора. В остальных случаях трансплантация возможна.

3) Иммуносупрессивную терапию проводят всем больным до и после трансплантации. Исключение составляют те случаи, когда донор и реципиент — однояйцовые близнецы. Современные подходы к иммуносупрессивной терапии предусматривают одновременное использование нескольких иммунодепрессантов и их назначение до и после трансплантации для профилактики и лечения отторжения трансплантата. В настоящее время в качестве иммунодепрессантов применяются кортикостероиды, азатиоприн,циклоспорин, моно- и поликлональные антитела. Эти препараты препятствуют активации иммунного ответа или блокируют эффекторные механизмы иммунитета.

А. Циклоспорин — один из новых, но уже нашедших широкое применение иммунодепрессантов. Его назначают до, во время и после трансплантации. Препарат ингибирует синтез интерлейкина-2, подавляя таким образом пролиферацию цитотоксических T-лимфоцитов. В высоких дозах циклоспорин обладает нефротоксическим действием, а при длительном применении вызывает пневмосклероз. Несмотря на это, по сравнению с комбинацией преднизона и азатиоприна циклоспорин снизил отторжение трансплантированной почки в течение 1-го года на 10—15%. Отторжение трансплантатов в течение 1-го года при применениициклоспорина составляет 10—20%. На отторжение трансплантата в более поздние сроки циклоспорин не влияет.

Б. Такролимус по механизму действия сходен с циклоспорином, но отличается от него по химическому строению. Такролимусугнетает активацию и пролиферацию цитотоксических T-лимфоцитов за счет подавления продукции интерлейкина-2 и интерферона гамма. Препарат эффективен в более низких дозах, чем циклоспорин, однако также обладает нефротоксическим действием, поэтому пока не получил широкого распространения. В настоящее время препарат проходит клинические испытания при трансплантации почки, печени и сердца. Предварительные результаты свидетельствуют, что такролимус высокоэффективен при остром и хроническом отторжении после трансплантации печени. Такролимус в большей степени, чем циклоспорин, отдаляет отторжение трансплантата и повышает выживаемость больных. Кроме того, назначение такролимуса позволяет снизить дозу кортикостероидов, а иногда и полностью отменить их.