Основы технологии, процессы и аппараты биотехнологических производств

Некоторые виды сырья, например,  соевая мука, вызывают повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенообразования при стерилизации в такие среды добавляют жир в качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает (устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне  нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стерилизовать отдельно. Для этого, как правило, предварительно готовят водно-масляную или водно-жировую эмульсию с хозяйственным мылом, повышающим ее стойкость.

Качество используемой воды зависит от назначения питательной  среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже - водопроводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть  прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезаменителей используют только апирогенную воду (бидистиллят).

Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воздействия, обеспечивающий удаление из них микробов - контаминантов или разрушение (гибель) последних. Наиболее распространенным и универсальным среди возможных методов, вызывающих деструкцию микроорганизмов, является метод, основанный в использовании высоких температур. Клетки микроорганизмов, а так же их споры более чувствительны к тепловому воздействию, чем большинство химических веществ, используемых в питательных средах. На практике главная цель стерилизации - достижение стерильности, при сохранении качества питательной среды. Длительность экспозиции, или время выдержки - это тот временной интервал, в пределах которого погибают микроорганизмы, но сохраняется качество питательной среды..

Тепловую стерилизацию сред (по способу ее проведения) подразделяют на периодическую и непрерывную. При периодическом способе стерилизации процессы: нагрев, выдержка и охлаждение среды  протекают последовательно во времени в одном аппарате. Это может быть ферментер, посевной аппарат или специальный стерилизатор. Весь объем среды нагревают в аппарате до заранее выбранной температуры, выдерживают при этой температуре строго определенное время и охлаждают водой, подаваемой в рубашку аппарата или змеевик. Сам процесс нагрева осуществляют либо путем прямого введения (инжекции) струи перегретого пара с температурой до 130⁰С в питательную среду, либо подачей пара в тепловую рубашку аппарата. Метод отличается простотой и надежностью, однако имеет и свои недостатки.

1. В частности, ухудшается качество питательной среды из-за длительного воздействия высокой температуры, при этом происходит карамелизация сахаров (образование ангидридов сахаров), деструкция витаминов; излишне длительный нагрев приводит не только к разрушению питательных веществ, но и к образованию в среде потенциальных ингибиторов процесса ферментации, таких как аминосахара.

2. Второй недостаток связан с тем, что повышенный расход пара происходит периодически, что обусловливает неравномерность работы котельной.

3. Если процесс стерилизации  питательной среды осуществляется  непосредственно в ферментере, то  значительно увеличивается время  простоя аппарата.

4. Получение большого количества пара является весьма затратным процессом. Одним из способов уменьшения затрат могла бы быть частичная регенерация тепла, выделяющегося при остывании простерилизованной питательной среды. Это тепло можно использовать для получения горячей воды и использовать для бытовых и технологических нужд. Однако в периодическом режиме это сделать сложно и неудобно.

 5. Последний, пятый, недостаток касается трудности автоматизации процесса периодической стерилизации по сравнению с непрерывным.

При непрерывном способе стерилизации каждый элементарный процесс - нагрев, выдержка, охлаждение осуществляется в специально предназначенных для этого апаратах: нагревателе, выдерживателе, теплообменнике, которые составляют систему аппаратов для непрерывной стерилизации - установку непрерывной стерилизации (УНС). Непрерывная стерилизация имеет следующие преимущества по сравнению с периодической:

1)  при непрерывном методе стерилизации каждый элементарный объем среды (бесконечно малый объем, содержащий спору) находится при более высокой температуре более короткое время;

2)   благодаря более высоким  температурам стерилизации и короткой экспозиции (выдерживании) деструкция компонентов питательной cpеды минимальна;                    

3)   процесс  стерилизации  всего  объема питательной  сред растянут во времени, этим  обеспечивается более равномерная загрузка котельной;                                                                   

4)  процесс легко контролируем  и управляем;                   

5)  отработанное тепло выделяется постоянно и равномерно, что обеспечивает возможность его использования для получения горячей воды.

 Непрерывное нагревание среды  может быть осуществлено без прямого контакта с теплоносителем в трубчатом, пластинчатом или спиральном теплообменнике, который встроен в стерилизатор или стоит перед ним. Но чаще всего среда нагревается до нужной температуры в течение нескольких секунд прямым  введением (инжектированием) перегретого пара (100-140⁰С), полученного в паровых контактных нагревателях.

Для стерилизации небольших объемов  растворов используют фильтрование через специальные фильтры-мембраны, задерживающие бактериальные клетки, а иногда и вирусы. Обычно этот способ используют для стерилизации растворов веществ, неустойчивых к нагреванию, а так же конечных продуктов (например лекарственных веществ белковой  природы).

Твердые сыпучие среды, используемые для поверхностного способа культивирования, стерилизуют паром, иногда инфракрасными и γ-лучами. Стерилизация твердых питательных сред водяным паром сопровождается, как правило, комкованием частиц среды. Поскольку компоненты твердых питательных сред (жмыхи, шелуха семян, опилки) обладают низким коэффициентом теплопроводности, то комкование препятствует нормальному течению процесса стерилизации, особенно в глубине комков. Для достижения необходимого эффекта обычно используют перегретый (острый) пар (до 140⁰ С), однако это не обеспечивает абсолютной стерильности Однако он вполне достаточен для проведения многих процессов, таких как получение ферментов или органических кислот.

Подготовка воздуха

Одной из важных задач биотехнологии является получение большого количества стерильного воздуха. В наибольших масштабах стерильный воздух применяется в процессах культивирования для аэрации. Его также используют для вентиляции участков цехов так называемой стерильной зоны, где в асептических условиях проводят,  например,  последние стадии очистки и фасовки готового продукта.  В атмосферном воздухе,  наряду с инертными газами, азотом, кислородом, диоксидом углерода, содержатся пары воды и мелкодисперсные частицы. В состав дисперсных частиц, наряду с частицами пыли, копоти, входят клетки и споры микроорганизмов как в свободном, так и в сорбированном на пылевых частицах виде.

Температура и влажность наружного  воздуха, количество в нем пылинок и микроорганизмов непостоянны и зависят от времен года (микроорганизмов летом в 10 раз больше, чем зимой), погодных условий - наибольшее количество пыли и, соответствено микроорганизмов приходится на сухую ветреную погоду, геогра- фического расположения предприятия, высоты забора воздуха т. д. Особенно много микробов у поверхности земли, с высотой концентрация их убывает и становится постоянной на уровне около 30 м над землей.

Очистку воздуха можно осуществить принципиально разными методами, основаными либо на уничтожении микроорганизмов, либо на удалении их. Одним из самых эффективных способов стерилизации воздуха, является облучение ультрафиолетовыми лучами. Этот метод используется для обеззараживания воздуха в боксах и технологических помещениях .

Отечественным и зарубежным опытом показано, что технически и эконо-мически оправданным в промышленности является способ очистки больших количеств воздуха на фильтрах с помощью волокнистых и пористых материалов. Таким путем удается получить воздух со степе чистоты 99,9999%. Взвешенные в воздухе частицы задерживаются волокнистым материалом благодаря инерционному и диффузионному механизмам осаждения. В общих чертах механизм инерционного осаждения основан на том, что когда воздушный начинает обтекать нить волокна на своем пути, взвешенные в этом потоке частицы движутся по инерции, отклоняются от потока воздуха и осаждаются на волокне. Эффект инерционного осаждения высок на сравнительно грубых волокнах для относительно крупных частиц и высоких скоростей воздуха. Малые частицы способны к броуновскому движению. Движущиеся вблизи волокна частицы диффундируют в случайных направлениях и могут задерживаться на поверхности волокон. Этот эффект осаждения увеличивается  с уменьшением диаметра частицы, диаметра волокна и скорости воздуха.

Если очищенный воздух используют в процессе поверхностного культивирования то он должен быть дополнительно кондиционирован до необходимой температуры и влажности.

Подготовка  и наработка продуцента.

Современные биотехнологические процессы характеризуются использованием аппаратов – ферментеров большого объема (50-500 м³). Запуск процесса культивирования и выведение его на рабочий режим (достижение оптимальной плотности клеточной культуры) является одной из самых сложных и длительных процедур. Часто процесс приходится останавливать в самый последний момент и начинать все сначала из-за попадания в аппарат посторонней микрофлоры или потери клетками, по разным причинам, частично или полностью своих продуктивных свойств. Поэтому приготовления посевного материала является одним из самых сложных, длительных и ответственных этапов всего процесса.

Для любого микробиологического  производства  всегда  необходима исходная культура продуцента, которая, как  правило,  не  отличается высокой  стабильностью при хранении. Поэтому, обычно, предприятие один  раз в 2-3 месяца получает чистую  культуру  в  количестве  3  пробирок  из специальной лаборатории профильной фирмы или  НИИ,  либо  в условиях собственной заводской лаборатории организует ее хранение и контроль микробиологической чистоты используемого штамма. При этом обычно  одну  пробирку  с   исходным   продуцентом   используют   на размножение исходного  штамма,  вторую  используют  для  организации микробиологического контроля за исходным штаммом-продуцентом, третью оставляют в резерве.

Объем пробирки и количество клеток микроорганизма в ней ничтожно мало по сравнению с объемом ферментера и поэтому прямой пересев культуры потребует очень длительного времени, пока не будет достигнута необходимая плотность культуры во всем аппарате. С целью сокращения времени на запуск процесса в производственных условиях наработку  необходимого количества биомассы осуществляют, как правило, в несколько стадий (не более 4-х) в специальных аппаратах.

     Подготовку биообъектов проводят согласно прилагаемым  к регламентам инструкциям. В этих целях исходный штамм микроорганизма или споровый материал (для грибов или актиномицетов), сохраняемый в условиях, близких к анабиозу или анабиоза (высушенным в стерильной почве, песке, на пшене, путем лиофилизации, или сублимационной сушки), оживляют после добавления стерильной жидкой питательной среды с последующим высевом на уплотненную питательную среду (агар). Убедившись в подлинности и чистоте культуры (культура называется чистой, если родительские и дочерние клетки в ней практически неразличимы и между ними нельзя установить родственные связи), операции по пересеву штамма на богатую питательными веществами среду возрастающих объемов (или площади) повторяют несколько раз в асептических условиях, переходя от пробирок к колбам различного объема, помещаемым на качалочные устройства (шюттель-аппараты).

    Окончательную наработку биообъекта осуществляют в цехе, используя небольшие ферментаторы-инокуляторы (1-2 стадии), в которых  наращивают посевной материал для промышленных ферментаций в количестве 5-20% от объема питательной среды в основном аппарате. При этом одноклеточные культуры чаще доводят до середины-окончания Log-фазы, что позволяет сильно сократить время адаптации клеток (Lag-фазу) при переносе их на питательную среду в производственный ферментер.

По своей конструкции  и технологической оснастке инокулятор для аэробных микроорганизмов аналогичен основному ферментеру и снабжен системами аэрирования, перемешивания, термостатирования. В инокуляторах, как и в промышленных ферментерах целесообразно поддерживать  незначительное избыточное давление воздуха, когда случайные утечки  будут происходить только в направлении  из системы, а не наоборот, что значительно облегчает поддержание асептических условий.

ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Технология  микробиологического синтеза обязательно  включает  в  себя  в  качестве  основной  стадию  промышленного   культивирования соответству-ющего микроорганизма-продуцента (ферментация). В условиях промышленного производства такое культивирование проводят по одному  из  следующих двух способов:

1. культивирование на твердых питательных средах или  на  поверхности тонкого  слоя  жидкой  питательной   среды   (поверхностный   способ выра-щивания продуцента),

2.  культивирование соответствующего  продуцента  в  большом  объеме жидкой фазы, содержащей все  необходимые  для  нормального  роста  и развития  микроорганизма  питательные  вещества  (глубинный   способ выращивания продуцента).

Поверхностное культивирование

      Культивирование микроорганизмов на твердых  питательных  средах -поверхностное культивирование) приблизительно можно  представить  в виде следующей последовательности технологических операций. Предварительно простерилизованный и  измельченный  твердый питательный субстрат  засевается  выращенной  в  отделении   «чистой   культуры» заводской  лаборатории  культурой  соответствующего  микроорганизма.  Далее среду с посевным материалом направляют в раздаточное устройство где с помощью механических дозаторов осуществляется загрузка  кювет (лотков) для выращивания. Перед загрузкой кюветы тщательно моют и стерилизуют острым паром. Загруженные кюветы помещают в специальные растительные камеры,  где   для нормального   роста   культур   микроорганизмов поддерживаются соответствующие условия.