Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производств

Получаемые подобным образом  клетки могут быть или разрушены  с целью выделения и последующей  очистки соответствующего антигена – рекомбинантные вакцины, или вводятся в организм – векторные вакцины.

Векторные (рекомбинантные) вакцины

Рекомбинантные  вакцины  - для производства этих  вакцин  применяют рекомбинантную технологию, встраивая генетический материал  микроорганизма  в дрожжевые клетки, продуцирующие антиген. После культивирования дрожжей из них выделяют нужный антиген, очищают и готовят вакцину. Примером таких  вакцин  может служить  вакцина против гепатита В (Эувакс В).

Для создания векторных живых  вирусных вакцин используют аттенуированный ДНК-содержащий вирус, в геном которого встраивается необходимый предварительно клонированный ген.

Вирусный вектор создает  иммунитет против заболеваний:

   1) Заболевания, вызываемого  данным вирусом

   2) Заболевания, вызываемого  инфекционным агентом – хозяином  встраиваемой в вирусный геном  ДНК.

Экспериментальные векторные  вакцины на основе вируса осповакцины получены к ветряной оспе, гриппу А, гепатиту А и В, малярии, простому герпесу.

Другой подход к созданию вакцины заключается в использовании  в роли векторов аттенуированных бактерий. Естественным кандидатом такого вектора является вакцина БЦЖ, поскольку геном этих бактерий по расчетам достаточно велик для включения генов любых других микробов. В качестве вектора можно также использовать ряд мутантных штаммов сальмонелл, способных при пероральном введении проиммунизировать лимфоидную ткань кишечника. Эти бактерии идеально подходят как векторная вакцина для индукции местного иммунитета в кишечнике – очень важная задача, если учесть, что диарейные заболевания составляют главную причину детской смертности на земном шаре. Еще одно преимущество аттенуированных микроорганизмов как векторов заключается в том, что их могут поглощать макрофаги, вызывая в результате системный иммунный ответ вследствие миграции в другие части тела. [1]

 

 

 

 

 

3 Требования к  производству вакцин

 

Требования к производству иммунобиотехнологических препаратов изложены в ряде документов по надлежащей производственной практике GMP, в разделах посвященных производству биологических и генно-инженерных продуктов. В отличие от препаратов, как правило, получаемых и контролируемых воспроизводимыми химическими и физическими методами, биологические препараты производятся с использованием биологических процессов и материалов, таких как культуры клеток, живые микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы), кровь или плазма человека, животных и т.п. Эти процессы отличаются присущей им вириабельностью, так что диапазон и природа побочных продуктов также варьируется. Кроме того, контроль препаратов осуществляется на лабораторных животных, культуре клеток, живых микроорганизмах. По этой причине при производстве биологических препаратов необходимо точнейшее следование принципам GMP на всех стадиях производства.

   1. Для всех производственных  операций должны существовать  стандартные рабочие методики, стандартные  операционные процедуры, стандарты  предприятия.

   2. В спецификации  на исходное сырье должны быть  включены подробные описания  их источников происхождения  и метода производства, а также  применявшихся методов контроля, в частности, микробиологической  чистоты.

   3. Питательные среды  следует вводить в биореакторы или ферментаторы в тщательно контролируемых условиях, обеспечивающих исключение загрязнения.

   4. При осуществлении  инактивации (при получении анатоксинов и вакцин), то следует принять меры, которые позволят избежать риска перекрестной контаминации инактивированного и неинактивированного продуктов.

   5. Чтобы избежать нежелательного дрейфа свойств, который может наблюдаться при повторяющемся субкультивировании или множественном воспроизведении, производство препаратов, получаемых с помощью микробных культур (например, вакцина БЦЖ), клеточных культур (например, вакцины против кори или полиомиелита), или размножением в эмбрионах или животных, должно основываться на системе главных и рабочих партий посевного материала или банка клеток.

   6. Количество поколений  (удвоений) между партией посевного  материала или банком клеток  и конечным продуктом должно  согласовываться с досье препарата.  Масштабирование процесса не  должно менять этого фундаментального  соотношения. Партии посевного  материала и банки клеток должны  быть созданы, храниться и использоваться  таким образом, чтобы свести  к минимуму риск загрязнения  или изменения. Должен проводиться  постоянный мониторинг температуры  хранения материала с фиксацией  полученных результатов. Любые  отклонения от установленных  пределов и любые предпринятые  действия по корректировке должны  протоколироваться.

   7. Только уполномоченному  персоналу должна быть разрешена  работа с материалом. Эта работа  должна выполняться под контролем  ответственного лица. Доступ к  хранящемуся материалу должен  контролироваться. Различные партии  посевного материала или банки  клеток должны храниться таким  образом, чтобы предотвратить  путаницу или перекрестное загрязнение.

   8. Центрифугирование,  сепарирование или смешивание  продуктов может привести к  образованию аэрозолей. При этом  необходимо принимать меры предосторожности  для предотвращения переноса  живых микроорганизмов.

   9. Для хроматографической очистки ряда препаратов (например, вакцины против гепатита В, полиомиелита) используется целый ряд оборудования, и, как правило, такое оборудование должно быть предназначено для очистки одного продукта, должно стерилизоваться и проходить санитарную обработку между партиями. Не рекомендуется использование одного и того же оборудования на различных этапах обработки. Должны быть определены критерии приемлемости, срок службы и способы санитарной обработки и стерилизации колонок.

   10. Критические стадии  производственного процесса биологических  препаратов и существенные изменения  производственного процесса должны  пройти валидационные исследования.

   11. Во время производства  необходимо составлять протоколы  рукописным способом  или с  использованием записывающего прибора,  который документально подтверждает, что действительно проведены  все стадии, требуемые установленными  методиками и инструкциями, а  также, что количество и качество  продукции соответствует запланированным  нормам. Любые значительные отклонения  должны быть полностью запротоколированы  и исследованы. Протоколы производственного  процесса, позволяющие исчерпывающе  проследить историю серии,  следует  составлять в полной и доступной  форме.

   12. Следует отметить, что новый продукт может требовать  дополнительных доклинических исследований, подтверждающих его исходное  клиническое применение. Необходимо  включать информацию о процессе  очистки и предоставлять данные  о стабильности, показывающие стабильность  продукта в течение клинических  испытаний. В дополнение к этому  может возникнуть потребность  в проведении исходных клинических  испытаний на небольших исследуемых  группах или с повышением дозы  вакцины с целью установления  безопасности продукта. Кроме того, может быть необходимым проведение  прямого сравнения старых и  новых продуктов в ходе рандомизированных клинических испытаний, чтобы установить взаимосвязь между функционированием двух продуктов.[4]

 

 

 

4 Методы получения современных вакцин

 

Живые вакцины получают, используя аттенуированные (ослабленные) штаммы бактерий и вирусов. Основным свойством вакцинных штаммов, принципиально отличающих их от патогенных, является стойкая утрата ими способности вызывать в организме человека типичное инфекционное заболевание.

Методы получения аттенуированных штаммов:

   1. Путем селекции  спонтанно возникших вакцинных  штаммов с ослабленной вирулентностью (туляремийная и бруцеллезная вакцины).

   2. Длительное культивирование  в неблагоприятных условиях.

   3. Путем длительного пассирования в организме невосприимчивых животных или на куриных эмбрионах – метод адаптации к новому хозяину (вирусные вакцины).

   4. Методом гибридизации «актуальных» эпидемических штаммов вируса с холодоадаптированными штаммами, безвредными для человека (гриппозные вакцины).

   5. Воздействием на  патогенные культуры мутагенами  различной природы с последующим  отбором непатогенных вариантов,  сохранивших иммунные свойства.[3]

Инактивированные (убитые) корпускулярные вакцины получают путем инактивации бактерий или вирусов физическими или химическими мутагенами: прогревание при температуре 50-60ºС, обработка ультрафиолетовыми лучами или формалином, спиртом, фенолом и другими веществами с сохранением корпускулярности.

Этапы получения живых  и убитых вакцин:

   1. Выбор штамма  и разработка условий его культивирования.

   2. Накопление биомассы  клеток в биореакторах после предварительного внесения посевного материала.

   3. Концентрирование  биомассы.

   4. Инактивация культуры в случае получения убитой вакцины и выделение клеток живой вакцины.

   5. Стандартизация.

Химические вакцины готовят  из антигенов, извлекаемых из микробных  клеток и вирусов. В отличие от корпускулярных, химические вакцины  вызывают защиту против определенных патогенных субстанций возбудителя  и не содержат избыточного количества балластных структур. Химические вакцины  готовят из поверхностных структур вирусных частиц или микроорганизмов (капсидов и суперкапсидов вирусов, клеточных стенок и мембран бактерий), содержащих антигены, обладающие протективной активностью. К этой группе относятся также и анатоксины, представляющие собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, обезвреженных длительным воздействием формалина при повышенной температуре.

Этапы производства химических вакцин:

   1. Наработка биомассы  клеток возбудителя.

   2. Выделение протективного антигена путем дезинтеграции вирионов или экстракции из клеток с использованием органических растворителей.

   3. Очистка антигена (используют: ультрафильтрацию, центрифугирование  в градиенте концентрации сахарозы, гель-фильтрацию, хроматографию на  ионообменниках, аффинную хроматографию)

   4. Стерилизация вакцины.

   5. Стандартизация  и контроль качества вакцины.

Вакцины с искусственными адъювантами создаются, используя  естественные антигены и синтетические  носители.

Комбинированные вакцины  создаются на основе имеющихся монопрепаратов.

Генно-инженерные вакцины  – препараты, полученные с использованием рекомбинантных клеток. Принцип создания заключается в том, что в геном живых аттенуированных вирусов, бактерий, дрожей или клеток эукариотов (вектор) встраивается ген, кодирующий образование протективного антигена того возбудителя, против которого будет направлена вакцина.

Процесс создания рекомбинантных вакцин:

   1. Выделение или  получение гена, кодирующего протективный антиген.

   2. Внедрение гена  в экспрессирующий вектор (плазмида, фаг, вирус) и введение в пермиссивную клетку.

   3. Культивирование  модифицированного микроорганизма  in vitro.

   4. Выделение и очистка  требуемого антигенного продукта, используемого затем как вакцинный препарат.[3]

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Производство противовирусных вакцин. Основные этапы производства

 

Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. В  отличие от бактерий, вирусы не растут ни в каких других условиях, кроме  как в клетках живых организмов. При использовании целостных  организмов возникают немалые сложности. Каждый организм обладает спектром индивидуальных свойств, зависящих от самых различных  причин, но все они влияют на успех  заражения. Выбор животного того или иного вида и возраста зависит  от применяемого вида вируса. Наиболее широко используют белых мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов. Но для промышленного производства используют, в основном, культуры клеток. В настоящее время вакцины, получаемые в культурах клеток, отличаются большим  разнообразием: это вакцины против бешенства, чумы, гепатита, оспы, энцефалитов  и т.д.[2]

Индикация, идентификация  и определение титра вируса

После накопления вирусов  в клетках следующим этапом в  производстве вакцин является индикация, идентификация и определение  титра вирусного материала. Прямое непосредственное выявление вирусов  возможно с помощью электронного микроскопа, но при условии, что в  пробе содержится не менее 10-100тыс. вирионов в 1мл. Этот метод не всегда можно  применить.