Стафилококки

мкг/мл.

 

Ход исследования

 

Одну каплю суточной  бульонной  культуры  исследуемого  штамма

засевают с помощью петли  на поверхность агара (на одну чашку  можно

сеять не  менее  25 штаммов).  Посевы инкубируют 24 часа при 37°С,

регистрируют результаты.  Рост  штамма  в  виде   крупной   бляшки

свидетельствует об   его   устойчивости   к   новобиоцину.  Полное

отсутствие роста или наличие  небольшого  числа  отдельных  мелких

колоний дает основание считать  штамм чувствительным к новобиоцину.

 

Тест на фосфатазу

 

Определение фосфатазы  можно проводить двумя методами, дающими

совпадающие результаты,  с использованием двух разных реактивов (в

зависимости от наличия одного из них).

Принцип. Фермент  фосфатаза  отщепляет  фосфатную  группу   от

фосфорорганического соединения.  Образующийся в результате продукт

реакции либо уже является окрашенным, либо приобретает окраску при

добавлении соответствующего реактива.

Реактивы. Динатриевая соль пара-нитрофенилфосфата (1-й метод);

фенолфталеинфосфат натрия, 25% раствор  аммиака (2-й метод).

 

Ход исследования

 

1-й метод.  50  мг  пара-нитрофенилфосфата  (динатриевая соль)

растворяют в 3  мл  стерильной  дистиллированной  воды.  Указанный

раствор добавляют  к  100  мл  расплавленного  и охлажденного 1,8%

питательного агара,  перемешивают  и  разливают  в  чашки  Петри.

Конечная концентрация реактива в  среде составляет 0,05%.  Суточные

агаровые культуры исследуемых  штаммов  с  помощью  петли  сеют  на

среду (не  более  16  штаммов  на  одну  чашку).  Учет результатов

проводят после 18-24 часовой инкубации  при 37°С. Реакция считается

положительной, если  в  толще  среды вокруг выросшей колонии видна

зона интенсивного желтого окрашивания.

2-й метод.  Фенолфталеинфосфат  натрия  добавляют  к  агару   в

концентрации 0,01%.  Посев и инкубация  осуществляется также, как и

в предыдущем методе.  По окончании  инкубации на крышку чашки Петри

наливают 5-6 капель 25%  раствора  аммиака,  выдерживают  чашку  в

перевернутом состоянии  5-10  минут,  подвергая  выросшую культуру

воздействию паров аммиака,  после  чего регистрируют результаты.  О

положительной реакции     свидетельствует    появление    розового

окрашивания макроколоний.

 

Определение окисления  маннита

 

Принцип. При окислении маннита  в аэробных условиях, образуется

уксусная кислота,   которая  закисляет  среду,  что  выявляется  с

помощью индикатора.

Ингредиенты. Для  постановки опыта  рекомендуется плотная (1,8%

агара) среда с индикатором ВР и среда Хью-Лейфсона,  содержащие 1%

маннита. Среду разливают в чашки  Петри.

 

Ход исследования

 

Суточные агаровые  культуры  исследуемых штаммов сеют на среду

бляшками (не более 16 штаммов на одну  чашку).  Посевы  инкубируют

при 37°С, результаты регистрируют через 1 сутки. Появление желтого

окрашивания вокруг макроколонии  свидетельствует  о  положительной

реакции.

 

Фаготипирование штаммов S. aureus <*>

 

Для внутривидового  дифференцирования  S.  aureus  применяется

метод фаготипирования,   позволяющий   получить   фаговую    метку

большинства штаммов и с большей  долей вероятности решить вопрос об

идентичности или различии сопоставляемых культур,  что очень важно

для выявления  источников  и  путей распространения стафилококковой

инфекции.

--------------------------------

<*> -  Сухие  фаги Международного  набора (22 фага) выпускаются

предприятием по      производству      бактерийных      препаратов

НИИ эпидемиологии и  микробиологии  им. Н.Ф.Гамалеи  АМН  СССР.  В

каждую коробку вложена инструкция  по  применению  фагов  и  учету

результатов.

 

Принцип. Штаммы     S.     aureus    обладают    избирательной

чувствительностью к  литическому  действию  ряда   стафилококковых

бактериофагов, составляющих  Международный  набор  типовых  фагов.

Чувствительность исследуемого  штамма  к  одному  или   нескольким

типовым фагам определяет фаготип  штамма, т.е. его фаговую метку.

 

Схема идентификации  стафилококков

 

День 1.

Посев исследуемого материала на МЖСА или кровяной агар.

День 2.

А. Учет  наличия  лецитиназы  и  пигмента   (МЖСА),   гемолиза

(кровяной агар).

Б. Приготовление и просмотр окрашенных по Граму мазков.

В. Постановка и учет каталазной реакции.

Г. Отсев чистой культуры на косой  агар.

День 3.

А. Окончательный учет наличия пигмента.

Б. Постановка  теста  на  ферментацию  глюкозы  в   анаэробных

условиях.

В. Постановка реакции плазмокоагуляции и предварительный  учет

ее результатов.

Г. Отсев чистой культуры на бульон.

День 4.

А. Учет ферментации глюкозы.

Б. Окончательный учет реакции плазмокоагуляции и сопоставление

ее результатов с результатами определения  лецитиназы  и  пигмента

В зависимости от этого:

а) при вариантах 1, 2 и 3 штамм идентифицируется как S. aureus

- проводится фаготипирование;

б) при вариантах 5,  6 и 7 штамм  не относится к  S.  aureus  -

проводится его  дальнейшая  идентификация:  постановка  тестов  на

устойчивость к новобиоцину (посев  бульонной  культуры),  окисление

маннита, тест на фосфатазу (посев агаровой культуры);

в) при  вариантах  4  и  8   идентификация   еще   невозможна;

постановка тестов  на ДНК-азу  или ферментацию маннита в  анаэробных

условиях.

День 5.

А. Предварительный учет ферментации  глюкозы.

Б. Учет результатов фаготипирования S. aureus (см. пункт А дня

3).

В. Учет  результатов  определения  устойчивости к новобиоцину,

окисление маннита,  фосфатазы  (см.  пункт   Б   дня   3);   штамм

идентифицируется либо    как   S.   epidermidis,   либо   как   S.

saprophyticus, либо как S.  spp.  Идентификацию можно

считать окончательной  при  положительном  результате   анаэробной

ферментации глюкозы.

Г. Учет результатов определения  ДНК-азы (см.  пункт Б дня  3);

при  вариантах  4а и 8а (табл.  3) ход исследований тот же,  что в

пункте А дня 3; при вариантах 4б и 8б ход исследований тот  же, что

в пункте Б дня 3.

Д. Учет анаэробной ферментации маннита (см. пункт Б дня 3).

День 6.

А. Учет ферментации глюкозы.

Б. Учет ферментации маннита.

В. Учет результатов фаготипирования S.  aureus  и  результатов

определения устойчивости   к   новобиоцину,   окисления   маннита,

фосфатазы коагулазонегативных стафилококков (раздел Б, день 4).

День 7.

А. Окончательный учет ферментации  глюкозы.

Б. Учет ферментации маннита.

День 8.

А. Окончательный   учет   ферментации   маннита,   далее   ход

исследований как в разделе  Г дня 4.  Если положительный  результат

ферментации маннита   получен   ранее,   то   сроки   исследования

сокращаются.

День 9.

Учет результатов (см. раздел В дня 5).

1. Среда Хью-Лейфсона

2. Среда  с  индикатором  ВР и одним из углеводов 

 

 

 

 

 

 

 

ИЗУЧЕНИЕ АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ  СТАФИЛОКОККОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ.

 

Стафилококки присутствуют у большинства  людей и являются частью нормальной микрофлоры кожных покровов, слизистых оболочек и нижнего отдела кишечника. Род Staphylococcus включает около 20 видов, различающихся по значению в патологии человека, однако реальное клиническое значение имеют только два из них – S. aureus и S. epidermidis. Для практики наиболее важна идентификация S. aureus. По данным С.В.Сидоренко (2003 г.), приблизительно 40% людей являются постоянными носителями S. аureus на слизистых оболочках крыльев носа, коже подмышечных впадин и промежности, оставшуюся часть популяции относят к транзиторным и случайным носителям. Важное клиническое значение бактерионосительства определяется достаточной типичностью процесса транслокации (переноса) стафилококков с наружных кожных покровов и слизистых оболочек во внутреннюю среду организма хозяина с развитием широкого спектра заболеваний. Это позволяет рассматривать стафилококковое бактерионосительство как один из ведущих факторов риска развития различных гнойно-септических инфекций (ГСИ) и послеоперационных осложнений. Следовательно, с одной стороны стафилококки представляют опасность для самого бактерионосителя. С другой стороны, носительство стафилококков в носовых ходах может представлять опасность для окружающих за счет аэрогенного распространения, что особенно актуально в стационарах и организованных детских коллективах. Неблагоприятные факторы окружающей среды оказывают влияние не только на макроорганизм, но и на колонизирующие его микроорганизмы. В частности, усиливают действие механизмов агрессии потенциально патогенных бактерийи способность противостоять действию антибактериальных препаратов. Цель работы – определить чувствительность культур S.aureus вегетирующих на слизистой оболочке носа у бактерионосителей к антибактериальным препаратам. Материалы и методы- определена чувствительность к антибактериальным препаратам у 155 культур Staphylococcus aureus, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа у людей в возрасте от 20 до 50 лет, проживающих в городе Евпатория.

При обследовании носителей на стафилококковый биоценоз исследуемый материал (клетки эпителия слизистой носа) засевали на чашки с желточно-солевым агаром. После инкубировали при 37оС, в течение 24-48 часов производили количественную и качественную оценку выросших колоний, расчет показателя микробной обсемененности (ПМО). Число микробных клеток 103 и более на тампон является показателем высокой обсемененности и свидетельствует о бактерионосительстве, представляющим эпидемическую опасность. Выделение и идентификацию стафилококков проводили общепринятыми методами . При определении видовой принадлежности штаммов использовали микротесты фирмы «Lachema» (Чехия»). Тип стафилококкового бактерионосительства определяли по антилизоцимной активности (АЛА) штамма. При наличии у золотистых стафилококков АЛА-признака бактерионосителей относили к резидентным. Чувствительность выделенных культур определяли к 12 антибактериальным препаратам диско - диффузионным методом в соответствии с «Методическими указаниями по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (Наказ 05.04.2007 №167 Про затвердження методичних вказівок «Визначеня чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів»), с применением расширенного набора дисков («Биорад»). Исследование устойчивости к метициллину проводили методом серийных разведений в жидкой питательной среде с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК). Для приготовления основного раствора антибиотика использовали оксациллин («Биорад»).

В таблице представлены результаты изучения распространенности штаммов стафилококков, резистентных к некоторым антибиотикам, носителей в возрасте от 20 до 50 лет жителей города Евпатория за последние 5 лет.

 

Число изученных культур	Количество штаммов (%), устойчивых к
	пенициллин	стрептомицин	тетрациклин	хлорамфеникол	эритромицин	мономицин
155	100	77	30	50	90	15

 

Вывод: Из представленных данных трудно провести какую-то закономерность, но они с определенностью свидетельствуют  о накоплении у носителей стафилококков, обладающих устойчивостью к пенициллину  и стретомицину. Стафилококки, резистентные к другим антибиотикам распространенны незначительно. И соответственно лечение инфекций, вызываемых S.aureus, у может быть затруднено в связи с высокой устойчивостью к антибактериальным препаратам основных групп.