Физиологический период исторического развития микробиологии

Параллельно со школой Л. Пастера развивалась и достигла больших успехов немецкая школа микробиологов, основоположником которой был Роберт Кох (1843—1910). Когда Кох учился в Геттингенском университете, Луи Пастер опубликовал свои знаменитые работы, в которых опроверг теорию самопроизвольного зарождения живых организмов из неживого вещества и разработал микробную теорию брожения. И хотя Пастер тогда еще не исследовал роль микробов в развитии заболеваний у человека, такое предположение вызвало бурную дискуссию. Через 20 лет после опубликования работ Пастера Иаков Генле в эссе «О миазмах и заражениях» ("Von den Miasmen und Contagion") сформулировал основные идеи о том, как можно доказать, что отдельные заболевания вызываются специфическими микроорганизмами – возбудителями. Однако, хотя эссе и содержало теоретически убедительные аргументы, практическая его проверка казалась с точки зрения технологии того времени невозможной.

В 1866 г. Кох получил медицинский диплом, а затем у него наступил период неустроенности, когда он работал в различных больницах и пытался организовать частную практику в пяти различных городах Германии. Кох хотел стать военным врачом или совершить кругосветное путешествие в качестве корабельного доктора, однако такой возможности у него не было. В конечном счете Кох обосновался в немецком городе Раквице, где начал врачебную практику и вскоре стал известным и уважаемым врачом. Однако эта работа Коха была прервана, когда в 1870 г. началась франко-прусская война.

Несмотря на сильную близорукость, Кох добровольно стал врачом полевого госпиталя и здесь приобрел большой опыт в лечении инфекционных болезней, в частности холеры и брюшного тифа. Одновременно он изучал под микроскопом водоросли и крупные микробы, совершенствуя свое мастерство в микрофотографии.

В своих работах Кох подвел окончательную черту под многолетней дискуссией о природе бактерий, обнаруживаемых у больных сибирской язвой животных. Дискуссия шла по вопросу: являются ли обнаруживаемые бактерии случайными спутниками болезни или причиной ее?6

Кох обнаружил, что в окрестностях Вольштейна распространена сибирская язва, эндемическое заболевание, которое вызывается бактерией Bacillus anthracis и распространяется среди крупного рогатого скота и овец, поражает легкие, вызывает карбункулы кожи и изменения лимфоузлов. Вскоре Кох начал изучать с помощью микроскопа возбудителя, который предположительно вызывал сибирскую язву.

Проведя серию тщательных, методичных экспериментов, Кох установил, что единственной причиной сибирской язвы была бактерия Bacillus anthracis. Он доказал также, что эпидемиологические особенности сибирской язвы, т.е. взаимосвязь между различными факторами, определяющими частоту и географическое распределение инфекционного заболевания, обусловлены циклом развития этой бактерии. Исследования Коха Bacillus-anthracis впервые доказали бактериальное происхождение заболевания. Его статьи по проблемам сибирской язвы были опубликованы в 1876 и 1877 гг. при содействии ботаника Фердинанда Кона и патолога Юлия Конгейма в университете Бреслау (ныне польский город Вроцлав). Кох опубликовал также описание своих лабораторных методов, в т. ч. окраски бактериальной культуры и микрофотографирования ее строения. Результаты исследований Коха были представлены ученым лаборатории Конгейма, в том числе, Паулю Эрлиху.

Коху микробиология обязана, прежде всего тем, что он усовершенствовал бактериологическую методику. Он предложил метод выделения чистых культур из изолированных колоний на плотных средах, способы окраски бактерий анилиновыми красителями и внес усовершенствования в технику микроскопирования - конденсор Аббе и иммерсионные объективы. Все это способствовало широкому распространению экспериментальных исследований микроорганизмов и разработке бактериологических методов диагностики инфекционных болезней.

Существовавший в то время метод разведений микробных культур был трудоемок и не надежен. Большие перспективы открывали наблюдения И.Щретера о способности бактерий образовывать отдельные скопления – колонии на картофеле, клейстере или яичном белке. Первоначально Кох остановился на картофельных пластинках, но они имели недостатки: подвижные бактерии свободно перемещались по влажной поверхности, используемый субстрат был не прозрачным, что затрудняло изучение калоний; кроме того, не все бактерии были способны расти на картофеле. Позднее Кох стал использовать желатину, засевая ее небольшим количеством бактерий быстро и без нажима разнося его по поверхности платиновой петлей, то есть проводя посев штрихом. Вскоре он отметил, что бактерии можно не рассеивать штрихом по поверхности затвердевшей желатины, а смешивать их с расплавленной и охлажденной желатиной. После застывания желатины бактерии оказывались иммобилизованными в ее толще и давали начало росту отдельных колоний (глубинный посев). Однако многие бактерии гидролизовали желатину разжижая субстрат, поэтому желатину пришлось заменить свернувшийся сывороткой крови, а потом агаром. Затем бактерии из отдельных колоний Кох переносил в пробирки с желатиной, застывшей под наклоном, получая чистые косяковые культуры. Возможности метода выделения чистых культур на твердых питательных средах позволяли четко установить этиологическую роль того или иного возбудителя и изучать его свойства, что было невозможно сделать на бульоных культурах. Поэтому все бактериологические находки, сделанные до этого, нуждались в подтверждении с выделением и исследованием чистых культур возбудителей. В дальнейшем основываясь на опыте выделении чистых культур возбудителей, Кох разработал основные теоритические и практические принципы проведения дезинфекции. Не менее важным вкладом Коха и его коллег в практическую бактериологию стала разработка селективных питательных сред продиктованная стремлением создать в пробирке среду, наиболее сходную с условиями пребывания патогена в тканях хозяина. В качестве основных ингредиентов были использованы мясные настои и экстракты, и в практику прочно вошли питательные бульоны и агары. Именно разработка новых ранее неизвестных методов выделения и культивирования бактерий привело к открытию возбудителей холеры, туберкулеза и многих других патогенных микроорганизмов. В немалой степени ом способствовали усовершенствования техники микроскопии: ахроматические объективы Амичи, иммерсионные системы Харнака и Аббе, микровинт Шевалье и др. Сам Кох также внес серьезные новшества в технику микроскопирования, предложив окрашивать микроорганизмы анилиновыми красителями и разработав методы микрофотографии.

В 1881 г. Кох опубликовал работу «Методы изучения патогенных организмов» ("Methods for the Study of Pathogenic Organisms"), в которой описал способ выращивания микробов в твердых средах. Этот способ имел важное значение для изолирования и изучения чистых бактериальных культур. В это время развернулась острая дискуссия между Кохом и Пастером, лидерство которого в микробиологии было поколеблено работами Коха. После того как Кох опубликовал резко критические отзывы о пастеровских исследованиях, касающихся сибирской язвы, между двумя выдающимися учеными вспыхнула нелицеприятная дискуссия, продолжавшаяся несколько лет, которую они вели как на страницах журналов, так и в публичных выступлениях. Многочисленные критики и сам Кох  обвиняли Пастера в «счастливой случайности» его открытий, на что тот отвечал, что «счастье улыбается только подготовленным умам». Если Пастер нередко заменял отсутствие фактических данных высочайшей интуицией (например, при изучении брожения), то Роберт Кох педантично добивался получения всех необходимых фактов микробного происхождения инфекционных болезней.

Позже Кох предпринимает попытки найти возбудителя туберкулёза, болезни в то время широко распространённой и являющейся основной причиной смертности. Близость клиники Шарите, заполненной туберкулёзными больными, облегчает ему задачу — он ежедневно, рано утром приходит в больницу, где получает материал для исследований: небольшое количество мокроты или несколько капель крови больных чахоткой.

Однако, несмотря на обилие материала, ему всё же никак не удаётся обнаружить возбудителя болезни. Вскоре Кох понимает, что достичь цели можно только с помощью красителей. К сожалению, обычные красители оказываются слишком слабыми, но спустя несколько месяцев работы ему всё же удается найти необходимые вещества.

Растёртую туберкулёзную ткань 271-ого препарата Кох окрашивает в метиловой синьке, а затем в едкой красно-коричневой краске, используемой в отделке кожи, и обнаруживает крохотные, слегка изогнутые, ярко-сине окрашенные палочки — палочки Коха.

Величайшего триумфа Кох достиг 24 марта 1882 г., когда он объявил о том, что сумел выделить бактерию, вызывающую туберкулез. В то время это заболевание было одной из главных причин смертности. В публикациях Коха по проблемам туберкулеза впервые были обозначены принципы, которые затем стали называться постулатами Коха. Эти принципы «получения исчерпывающих доказательств... что тот или иной микроорганизм действительно непосредственно вызывает определенные заболевания», вытекающие из тезисов Хенле, которые он сформировал за 36 лет до Коха,  до сих пор остаются теоретическими основами медицинской микробиологии.

Постулаты Коха:

1. Микроорганизм  обнаруживают в каждом случае  конкретного предполагаемого заболевания.

2. Микроорганизм  выделяют при других болезнях  как случайный и непатогенный паразит.

3. После изоляции  из организма больного и выделения  чистой культуры патогенный организм  должен вызвать аналогичное заболевание  у восприимчивого животного.

Изучение Кохом туберкулеза было прервано, когда он по заданию германского правительства в составе научной экспедиции уехал в Египет и Индию с целью попытаться определить причину заболевания холерой. Работая в Индии, Кох объявил, что он выделил микроб, вызывающий это заболевание — холерный вибрион. Открытия Коха сделали его одним из тех лиц, кто определяет направления развития здравоохранения, и в частности ответственным за координацию исследований и практических мер в борьбе с такими инфекционными заболеваниями, как брюшной тиф, малярия, чума крупного рогатого скота, сонная болезнь (трипаносомоз) и чума человека.

В 1885 г. Кох стал профессором Берлинского университета и директором только что созданного Института гигиены. В то же время он продолжал исследования туберкулеза, сосредоточившись на поисках способов лечения этого заболевания. В 1890 г. он объявил о том, что такой способ найден. Кох выделил так называемый туберкулин (стерильную жидкость, содержащую вещества, вырабатываемые бациллой туберкулеза в ходе роста), который вызывал аллергическую реакцию у больных туберкулезом. Однако на самом деле туберкулин не стал применяться для лечения туберкулеза, т. к. особым терапевтическим действием он не обладал, а его введение сопровождалось токсическими реакциями, что стало причиной его острейшей критики. Протесты против применения туберкулина стихли, лишь когда обнаружилось, что туберкулиновая проба может использоваться в диагностике туберкулеза. Это открытие, сыгравшее большую роль в борьбе с туберкулезом у коров, явилось главной причиной присуждения Коху Нобелевской премии.

В физиологический период, а именно в 1867 г., М.С. Воронин описал клубеньковые бактерии, а почти через 20 лет Г. Гельригель и Г. Вильфарт показали их способность к азотфиксации. В 1877 г. французские химики Т. Шлезинг и А. Мюнц доказали микробиологическую природу процесса нитрификации, а в 1882 г. В 1882 г. П. Дегерейн обнаружил аналогичную природу процесса денитрификации, а двумя годами позже он же установил микробиологическую природу анаэробного разложения растительных остатков. Российский ученый П.А. Костычев создал теорию микробиологической природы процессов почвообразования.

Большой вклад в развитие общей микробиологии внес голландский ученый М. Бейеринк (1851-1931), который внедрял микроэкологический принцип в исследование микроорганизмов. Круг научных интересов Бейеринка был необычайно широк. Ему принадлежат работы по исследованию физиологии клубеньковых бактерий, изучению процесса денитрификации и сульфат-редукции, работы по изучению ферментов разных групп микроорганизмов. В 1898 г. независимо от Д.И. Ивановского Бейеринком был описан вирус табачной мозаики.

Родоначальником русской микробиологии является Л. Ценковский (1822-1887). Объектом его исследований были микроскопические простейшие, водоросли, грибы. Он впервые дал научно обоснованную классификацию микроорганизмов, установил близость бактерий к сине-зеленым водрослям. А также открыл и описал большое число простейших, изучал их морфологию и циклы развития. Это позволило ему сделать вывод об отсутствии резкой границы между миром растений и животных. Им также была организована одна из первых Пастеровских станций в России и предложена вакцина против сибирской язвы («живая вакцина Ценковского»).

В 1892 г. русский ботаник Д. И. Ивановский (1864-1920 гг.) открыл вирус табачной мозаики. В 1898 г. независимо от Д.И. Ивановского этот же вирус был описан М. Бейеринком. Затем был открыт вирус ящура (Ф. Леффлер, П. Фрош, 1897 г.), желтой лихорадки (У. Рид, 1901 г.) и многие другие вирусы. Однако увидеть вирусные частицы стало возможным только после изобретения электронного микроскопа, так как в световые микроскопы они не видны. К настоящему времени царство вирусов насчитывает до 1000 болезнетворных видов. Только за последнее время открыт ряд новых Д. И. Ивановский вирусов, в том числе вирус, вызывающий СПИД.

С.Н. Виноградский (1856-1953 гг.) и голландский микробиолог М. Бейеринк (1851-1931 гг.) ввели микроэкологический принцип исследования микроорганизмов. Виноградский открыл процесс хемосинтеза, показав на примере нитрифицирующих бактерий, серобактерий и железобактерий, что в природе существуют микроорганизмы способные извлекать энергию при окислении восстановительных неорганических соединений. Также он предложил создавать специфические (элективные) условия, дающие возможность преимущественного развития одной группы микроорганизмов, открыл в 1893 г. анаэробный азотфиксатор, названный им в честь Пастера Clostridium pasterianum, выделил из почвы микроорганизмы, представляющие совершенно новый тип жизни и получившие название хемолитоавтотрофных. Виноградский опубликовал свыше 300 научных работ по экологии и физиологии почвенных микроорганизмов и поэтому его по праву считают родоначальником почвенной микробиологии.7

Микроэкологический принцип был развит и М. Бейеринком и применен при выделении различных групп микроорганизмов. Через 8 лет после открытия С.Н. Виноградским азотфиксатора М. Бейеринк выделил в аэробных условиях Azotobacter chroococcum, исследовал физиологию клу беньковых бактерий, процессы денитрификации и сульфатредукции и т.д. Поэтому Бейеринк, несомненно, также является основоположником экологического направления микробиологии, связанного с изучением роли микроорганизмов в круговороте веществ в природе.

Таким образом к концу XIX в. намечается дифференциация микробиологии на ряд частных направлений: общая, медицинская, почвенная.