Методы определения белка

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ  БЕЛКА

Молоко - один из самых ценных продуктов питания человека. Роль молока как полноценного пищевого продукта в поддержании процессов жизнедеятельности  организма хорошо известна. Особую ценность представляют белки молока - наиболее важные в биологическом  отношении органические вещества. Образующиеся в результате расщепления белков аминокислоты идут на построение клеток организма, ферментов, защитных тел, гормонов и прочее. Некоторые аминокислоты легко образуются в организме  из других кислот, но есть и такие, которые  должны поступать с пищей. Эти  аминокислоты (лизин, триптофан, метионин, фенилаланин, лейцин, изолейцин, треонин, валин) называют незаменимыми. Количество многих незаменимых аминокислот  в сывороточных белках молока значительно  выше не только по сравнению с белками  растительных продуктов, но и с некоторыми белками мяса и рыбы.

Кроме того, казеин и сывороточные белки молока обладают рядом важных функциональных свойств (водосвязывающая, эмульгирующая, пенообразующая способность), позволяющих использовать их концентраты  в качестве стабилизаторов, эмульгаторов разнообразных продуктов (мороженое, кремы, пудинги и прочее).

Обычно в молоке контролируют массовую долю белков (общий белок), включающих казеин и сывороточные белки. Реже в молоке определяют только содержание казеина.

Для контроля массовой доли белка в молоке имеется несколько  методов. Арбитражным считается  сложный химический метод Кьельдаля  ГОСТ23327-98 «Молоко. Методы определения  общего белка».

Метод Кьельдаля

Метод основан на сжигании органических компонентов пробы  молока в колбе Кьельдаля в  присутствии серной кислоты; освобождающийся  при этом азот определяют титрованием  и по его количеству вычисляют  содержание белка.

Для проведения измерения  в колбу Кьельдаля последовательно  помещают несколько стеклянных бусинок  или кусочков фарфора, около 10 г сульфата калия, 0,04 г сульфата меди. В бюксу  с крышкой отмеривают 5 см³ молока, крышку закрывают и взвешивают. Молоко из бюксы переливают в колбу. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице между массой бюксы с молоком и массой пустой бюксы вычисляют массу взятого молока. В колбу добавляют 20 см³ серной кислоты, осторожно вливая ее по стенкам колбы, смывая с них капли молока. Колбу закрывают грушеобразной стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое колбы.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении  под углом 45º и осторожно нагревают  до тех пор, пока не прекратится пенообразование  и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более  интенсивном нагревании. Степень  нагревания считают достаточной, когда  кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Кьельдаля.

Время от времени содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость не станет совершенно прозрачной и  практически бесцветной (при применении в качестве катализатора окиси ртути) или слегка голубоватой (при применении в качестве катализатора сульфата меди). После осветления раствора нагревание продолжают в течение 1,5 час., после чего колбе дают остыть до комнатной температуры. Добавляют 150 см³ дистиллированной воды и несколько кусочков свежепрокаленной пемзы, перемешивают и снова охлаждают.

В коническую колбу отмеривают 50 см³ раствора борной кислоты , добавляют 4 капли индикатора и перемешивают.

Коническую колбу соединяют  с холодильником с помощью  аллонжа и резиновой трубки так, чтобы конец аллонжа был погружен в раствор борной кислоты в  конической колбе. Колбу Кьельдаля  соединяют с холодильником при  помощи каплеуловителя, проходящего через одну пробку с делительной воронкой. Градуированным цилиндром отмеряют 80 см³ раствора гидроксида натрия (реактив 3) (при применении в качестве катализатора красного оксида ртути используют раствор гидроксида натрия, содержащий сульфид натрия) и через делительную (капельную) воронку вносят его в колбу Кьельдаля. Сразу же после выливания раствора кран делительной воронки закрывают для избежания потери образующегося аммиака.

Содержимое колбы Кьельдаля  осторожно смешивают круговыми  движениями и нагревают до кипения. При этом необходимо избегать пенообразования.

Перегонку продолжают до тех  пор, пока жидкость не начнет булькать. При этом регулируют степень нагрева  так, чтобы время дистилляции  было не менее 20 минут. Убедиться в  полноте перегонки аммиака можно  путем дополнительной перегонки  в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 минут. Окраска раствора борной кислоты должна оставаться без  изменений. При перегонке не допускают  нагревания раствора борной кислоты  в конической колбе. Слишком сильное  охлаждение

(ниже 10ºС) также нежелательно, так как оно может вызвать  переброс жидкости из конической  колбы в колбу Кьельдаля.

Перед окончанием перегонки  коническую колбу опускают так, чтобы  конец аллонжа был над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 минут.

После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Внешнюю и  внутреннюю поверхности аллонжа  ополаскивают небольшим количеством  дистиллированной воды, сливая ее в  коническую колбу.

Дистиллят титруют раствором  соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно так же, как  и основной проводят контрольный  опыт, применяя 5 см³ дистиллированной воды место молока. Количество повторностей контрольного опыта должно быть не менее 5.

По объему аммиака, определяемого  титрованием кислотой, устанавливают  количество общего азота при умножении  последнего на принятый коэффициент 6,38 и таким образом находят содержание общего белка в молоке.

Три следующих метода описаны  в ГОСТе 25179-90 «Молоко. Методы определения  белка».

Рефрактометрический метод

Метод основан на установлении разности показателей преломления луча света после прохождения его через молоко и полученной из него безбелковой сыворотки (для осаждения белков используют раствор хлорида кальция и нагревание пробы).

Массовую долю белков в  молоке данным методом определяют на рефрактометре ИРФ-464.

Для измерения в 3 флакона  наливают по 5 см³ молока, добавляют  по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и  перемешивают путем переворачивания  флаконов.

Далее флаконы помещают в  водяную баню, наливая воду таким  образом, чтобы ее максимальный уровень  достигал половины высоты флаконов. Баню закрывают, помещают на электроплитку, воду в бане доводят до кипения  и кипятят не менее 10 минут. Не открывая бани, горячую воду сливают через  отверстие в крышке, наливают в  баню холодную воду и выдерживают  в ней не менее 2 минут.

Открывают баню, извлекают  флаконы и разрушают белковый сгусток путем энергичного встряхивания флаконов.

Флаконы помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 минут. Образовавшуюся прозрачную сыворотку  отбирают пипеткой и наносят на измерительную  призму рефрактометра 1-2 капли. Измерительную  призму закрывают осветительной.

Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают  окрашенность границы света и  тени. Для улучшения резкости границы  измерение проводят через одну минуту после нанесения сыворотки на призму, так как за это время  из пробы удаляется воздух и поверхность осветительной призмы лучше смачивается.

По шкале «Белок» проводят не менее трех наблюдений. Затем  сыворотку с призмы рефрактометра  удаляют, промывают ее водой и  вытирают фильтровальной бумагой.

На измерительную призму помещают две капли исследуемого молока и по шкале «Белок» проводят не менее пяти наблюдений, так как  резкость границы света и тени у молока хуже, чем у сыворотки.

Массовую долю белка в  молоке Х₁ (%) вычисляют по формуле:

Х₁=Х₂-Х₃;

где Х₂ - среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для молока (%);

Х₃ - среднее арифметическое значение результатов наблюдения по шкале «Белок» для сыворотки (%).

Колориметрический метод

Колориметрический метод  основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки  связывать кислый краситель, образуя  с ним нерастворимый осадок, после удаления которого измеряют оптическую плотность исходного раствора красителя относительно полученного раствора, которая уменьшается пропорционально массовой доле белка.

Методика определения  массовой доли белков в молоке сводится к следующему. В пробирку отмеряют 1 см³ молока, приливают 20 см³ рабочего раствора сине-черного красителя (готовится  путем смешивания водного раствора красителя и кислого буферного  раствора с добавлением поверхностно-активного  вещества) и смесь интенсивно перемешивают. Выпавший осадок центрифугируют или  отфильтровывают. Полученный фильтрат разводят в 100 раз и колориметрируют  на фотоколориметре КФК-3 при длине  волны 500-600 нм в кювете с рабочей  длиной 10 мм. 

Массовую долю белков в  молоке устанавливают в процентах, пользуясь градуировочным графиком. Для построения графика в нескольких пробах молока (с массовой долей  белков 2,5-3,5%) определяют содержание белков методом Кьельдаля и оптическую плотность фильтрата, полученного  указанным способом.

Метод формольного  титрования

Метод применяют при условии  согласия с поставщиком.

Метод формольного титрования основан на нейтрализации карбоксильных  групп моноаминодикарбоновых кислот белков раствором гидроксида натрия, количество которого, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке. Для проведения подготавливают, согласно инструкции, рН-метр-термометр «Нитрон». Бюретку, вместимостью не менее 5 см³ с ценой деления не более 0,05 см³ заполняют раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм³. Для определения поправки к результатам измерения массовой доли белка методом формольного титрования проводят одновременное измерение массовой доли белка в одном и том же образце молока методом формольного титрования и по ГОСТ 23327.

В стакан помещают 20 см³ молока и стержень магнитной мешалки. Стакан устанавливают на магнитную мешалку, включают двигатель мешалки и погружают электроды потенциометрического анализатора в молоко. Титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН 4 и делают 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности. Определяют количество раствора щелочи, затраченной на нейтрализацию молока, до внесения формальдегида, и вносят в стакан 5 см³ формальдегида.

По истечении 2-2,5 минут  вновь титруют раствор гидроксида натрия в стакан с молоком до точки  эквивалентности равной 9 единицам рН, подавая раствор по каплям начиная с рН равное 4 и деляют 30-секундную выдержку после достижения точки эквивалентности.

Параллельно проводят контрольный  опыт по нейтрализации смеси 20 см³ воды и 5 см³ раствора формальдегида.

Массовую долю белка Х₇ (%) вычисляют по формуле:

Х₇=(V₂-V₁-V₀) 0,96+Х₄;

где V₂ - общее количество раствора, израсходованное на нейтрализацию, см³;

V₁ - количество раствора, израсходованное на нейтрализацию до внесения формальдегида (см³);

V₀ - количество раствора, израсходованное на контрольный опыт (см³);

0,96 - эмпирический коэффициент  (%/ см³);

Х₄ - поправка к результату измерения массовой доли белка (%).

Поправку Х₄ (%) вычисляют по формуле Х₄=Х₅-Х_6,

_ГДЕ Х₅ - среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное по ГОСТ23327 (%);

Х₄ - среднее арифметическое значение массовой доли белка, полученное формольным титрованием (%). 

Все вышеперечисленные методики определения белка имеют существенные недостатки: длительность определения, использование дорогостоящих реактивов, повышенная опасность для обслуживающего персонала.

Разработанный в последние  годы электронный ультразвуковой анализатор молока «Клевер-2» лишен этих недостатков. Без применения химических реактивов  прибор измеряет одновременно содержание массовой доли жира, сухого обезжиренного  молочного остатка (СОМО), плотность, белок, количество добавленной воды и температуру пробы.

Принцип действия прибора  основан на измерении скорости распространения  ультразвуковых колебаний в зависимости  от температуры и состава молока.

Анализатор молока «Клевер-2»  работает следующим образом. В режиме измерения дегазированную пробу  молока заливают в пробозаборник  прибора, где ее последовательно  нагревают до двух заданных температур, при каждой из которой определяют скорость ультразвука. На основе полученных данных микропроцессор автоматических вычисляет массовые доли белка, жира, плотности, СОМО, количество добавленной  воды и температуру пробы молока. Полученные значения отображаются на цифровом индикаторе прибора. Процесс  измерения полностью автоматизирован.

Прибор прост в обслуживании и портативен. Температура пробы  молока может быть от 10º до 30ºС. Время  измерения три минуты.

Использование анализатора  молока «Клевер-2» позволяет значительно  сократить трудовые ресурсы на проведение анализа, исключить приготовление  реактивов, характерных для традиционных методов, сократить площади лабораторий.

Анализаторы на основе ультразвукового  метода компактны, просты в эксплуатации, имеют умеренную цену и перспективны как на мини-заводах, заводах средней  мощности, так и на животноводческих фермах и в фермерских хозяйствах.