Получение лимонной кислоты

ВВЕДЕНИЕ

 

Лимонная кислота является основным подкислителем. Ее доля составляет около 75% объема всех производимых подкислителей. Особенно широко она используется в производстве безалкогольных напитков, которым придает фруктовые и ягодные запахи и вкус.

Расширяется сфера применения лимонной кислоты в технических целях — в химической, текстильной, кожевенной, металлургической и других отраслях промышленности. Спрос на лимонную кислоту непрерывно растет, но в бывших социалистических странах он удовлетворяется крайне слабо, поэтому в настоящее время организуются новые производственные мощности по выпуску этого ценного продукта.

Лимонную кислоту производят главным  образом путем микробного синтеза, который является важной отраслью биотехнологии. Настоящий отчет посвящен микроорганизмам—продуцентам лимонной кислоты и современным достижениям биотехнологии в области биосинтеза органических кислот. Описаны теоретические основы микробного синтеза и механизмы регуляции метаболизма органических кислот, их связь с общей физиологией микробных клеток. В работе отражен многолетний опыт авторов в промышленном биосинтезе органических кислот. Описываются способы утилизации отходов производства лимонной кислоты с целью получения ценных кормовых продуктов.

 

Лимонная кислота НООС-СН₂С(ОН) -СООН-СН₂-СООН является моноокситрикарбоновой кислотой, кристаллизующейся из водных растворов с одной молекулой воды (моногидрат лимонной кислоты) в виде бесцветных прозрачных ромбообразных кристаллов .Моногидратная лимонная кислота имеет молекулярную массу 210, плотность 1,540 г/см³ и температуру плавления 70—75 ^СС. Кристаллизационная вода теряется при хранении и интенсивно выделяется при температурах, превышающих 40—50 °С. При 100 °С вода теряется полностью.

При температуре кристаллизации 36,6 °С и выше выделяется безводная лимонная кислота с молекулярной массой 192 и температурой плавления 153 °С. При нагревании до 175 °С лимонная кислота разлагается.

Лимонная кислота хорошо растворяется в воде (1460 г/л при 20 °С) и умеренно — в этаноле (620 г/л при 25 °С).

          СН₂СООН

    |

НО—С—СООН

           I

          СНзСООН

Соли лимонной кислоты — цитраты  — имеют низкую водораство-римость.

Лимонная кислота широко распространена в природе. Особенно много ее в  незрелых фруктах и ягодах (лимоны, клюква, яблоки, виноград, брусника и др.),

где лимонная кислота является естественным консервирующим агентом.

Продуценты лимонной кислоты

После первых публикаций К.Вемера о  способностях микромицетов синтезировать  органические кислоты, в том числе лимонную, многие микробиологи стали тщательно изучать физиологию грибов и их биосинтетические способности. Многочисленные проверки показали явно выраженный потенциал сверхсинтеза лимонной кислоты у целого ряда микромицетов, дрожжевых грибов и бактерий. В зависимости от химической природы окисляемого субстрата (свекловичная, тростниковая, цитрусовая или финиковая меласса, сок сахарного тростника, гидрол, гидролизаты крахмала, багасса, сахароза, глюкоза, парафины и много других субстратов) в качестве продуцентов лимонной кислоты в более или менее широких масштабах используют микромицеты, принадлежащие к родам Aspergillus, Penicillium, Trichoderma и Botrytis, дрожжевые грибы родов Candida, Delaromyces и Torulopsis, а также бактерии родов Arthrobacterium, Pseudomonas и Micrococcus.

Детально изучены многочисленные представители аспергиллов, особенно Aspergillus awamori, A.aureus, A.clavatus, A.glaucus, A.niger.

Самым широко распространенным продуцентом лимонной кислоты является микромицет Aspergillus niger, физиология и механизм биосинтеза лимонной кислоты которого наиболее изучены.

 

В настоящее время  для биосинтеза лимонной кислоты  в качестве основного сырья широко используют мелассу — отходы сахароперерабатывающей промышленности. В зависимости от исходного материала различают свекловичную, тростниковую, цитрусовую и другие виды мелассы. На международном рынке ежегодна продается 30—35 млн. т этого сырья. В России ежегодный объем производства мелассы составляет 3 млн. т. Хотя меласса в основном используется для кормовых целей, ее широко применяют также в микробиологической промышленности.

Свекловичная меласса  характеризуется высоким содержанием 'Сахаров (46—55%), из которых преобладает  сахароза. Меласса имеет сложный  и непостоянный химический состав. Она содержит коллоиды, органические кислоты, витамины, белки и свободные .аминокислоты, сложный спектр минеральных веществ (табл. 4.8— 4.10). Из нелетучих органических кислот в мелассе могут присутствовать, %: лимонная — 0,01—0,5; глюконовая — 0,5—1,0; яблочная — 0,1—0,5; янтарная — 0,1—0,7.

Хорошо сбраживаемая меласса должна содержать не более 1% инвертного сахара и не более  1%  СаО и 0,06,%  сернистого газа (добавляемого в мелассу в качестве консервирующего агента) при общем содержании сухих веществ не менее 75% и Сахаров не менее 46,%   при невысоком  содержании живых микроорганизмов.

В золе свекловичной мелассы  много калия, магния, железа, но относительно мало фосфора.

Химический состав мелассы  зависит от климатических и почвенных условий

выращивания сахарной свеклы, применяемых минеральных удобрений, времени уборки урожая (поздние сроки уборки отрицательно влияют на качество мелассы), технологических нюансов переработки сахарной свеклы, условий транспортировки и хранения мелассы.

Производство мелассы связано с сезонными доставками сырья. В производстве лимонной кислоты наилучшие результаты дает зрелая, выдержанная меласса. Важное значение имеют длительность хранения мелассы и наличие герметически закрытых емкостей — мелассохранилищ с пневматическим перемешиванием (для предотвращения расслоения), насосами, устройствами для подачи и забора мелассы из разных горизонтальных хранилищ.

В последнее десятилетие качество мелассы ухудшается под влиянием ряда дополнительных факторов, связанных  с техническим прогрессом . Широко применяемые в сельском хозяйстве ядохимикаты и минеральные удобрения могут оставлять определенные отрицательные следы в сельскохозяйственной продукции, в частности в мелассе, где обнаружены инсектициды, например фосфорорганический инсектицид малатилон (до 90 мг в 1 кг мелассы), оказывающий ингибирующее влияние на биосинтез лимонной кислоты .

В мелассе установлено присутствие  некоторых фунгицидов (трилон, мертрилан  и др.). Данные о влиянии фунгицидов на биосинтез лимонной кислоты неоднозначны. Некоторые авторы утверждают, что ряд фунгицидов подавляет активность ферментов изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы и тем самым способствует биосинтезу лимонной кислоты, во всяком случае у дикорастующих культур Aspergillus niger . По данным других авторов, фунгициды отрицательно влияют на ацидогенез.

Обнаружено угнетение  синтеза белка в клетках Aspergillus niger под действием ртутьорганического фунгицида мертрилана. В результате его воздействия на ферменты ЦТК (в частности на малат-, изоцитрат- и сукцинатдегидрогеназы) резко понижаются интенсивность дыхания клеток и активность терминальных оксидо-редуктаз, особенно цитохромоксидазы. Фунгицид трилан (4,5,6-трихлорбензоксазолидон) также отрицательно влияет на метаболизм микромицета Aspergillus niger, по механизм его воздействия другой .

Все исследованные  фунгициды  подавляют  интенсивность  дыхания, тормозят синтез белка, нарушают проницаемость  цитоплазматических мембран .

    В   мелассе  нередко обнаруживается  присутствие детергентов.Их влияние на микроорганизмы изучено слабо. Установлено изменение проницаемости клеточной мембраны Aspergillus niger и как следствие   —   повышенная  гидроксилазная   активность   культуры.

Способ культивирования

    Успехи глубинной ферментации в производстве антибиотиков побудили производителей лимонной кислоты искать пути глубинного культивирования ее продуцентов. В СССР первой глубинное культивирование продуцентов лимонной кислоты освоила группа исследователей под руководством Г. И. Журавского в 50-е гг., применяя синтетические сахарозные среды и специально

селекционированный для глубинного культивирования штамм Aspergillus niger {. В качестве сырья для глубинной ферментации лимонной кислоты может быть использован широкий набор природных субстратов: меласса, глюкоза, сахароза, жидкие парафины и другие источники углерода .

Технология глубинного культивирования продуцентов лимонной кислоты представляет собой явно выраженный двухступенчатый процесс. Первая ступень включает выращивание  посевного материала из конидиоспор в посевной среде (на качалке и в посевном аппарате) при 32—33 °С в условиях хорошей аэрации (0,8—1,0 объема воздуха на 1 объем среды в минуту) и при непрерывном перемешивании среды. Продолжительность культивирования на стадии выращивания посевного материала — 2 сут (1 сут — на качалке, 1 — на посевном аппарате).

Сказанное принципиально  не исключает непосредственного  применения конидиоспор в качестве посевного материала для ос-

новной ферментации, однако это существенно удлиняет цикл ферментации: с 7—8 до 12—13 сут .

Основную ферментацию  в глубинных условиях осуществляют в производственном биореакторе  при коэффициенте его заполнения 0,75—0,80 и количестве посевного материала 5—8% от объема ферментируемой среды. Начальная  концентрация Сахаров — 10— 14%, часто применяют подкормку свежей средой, особенно в случаях применения мелассных сред . Регуляции рН среды не требуется, но поскольку лимонная кислота очень коррозионна и для ферментационного оборудования необходима устойчивая к коррозии сталь, то для смягчения коррозионное практикуют подщелачивание ферментируемого субстрата до рН 3,8—4,2.

Процесс ферментации  имеет черты двух фаз, или стадий: формирования биомассы и кислотообразования.      

Для фазы роста биомассы характерно объединение молодого мицелия в шарообразные агломераты, формирование которых продолжается до 70—80 ч ферментации. Некоторая часть гиф остается в свободном виде.

Во время интенсивного роста потребность продуцента в  молекулярном кислороде составляет до 1 кг па каждый кубометр ферментируемого субстрата в час. В фазе биосинтеза лимонной кислоты потребность в кислороде в некоторой степени снижается и составляет 0,5—0,6 кг 0₂/м³-ч. Для обеспечения массопередачи кислорода в ферментируемый субстрат вводится стерильный воздух в количестве 0,8—1,0 объема на 1 объем среды в минуту, одновременно с помощью мешалки создается циркуляция среды со скоростью, соответствующей 1,2—1,5 м/с вдоль стенки ферментатора. Насыщение среды кислородом в начальной фазе ферментации должно составлять 20—25,% от полного насыщения, в фазе биосинтеза лимонной кислоты — 10—15,%. Для обеспечения массооб-меиа молекулярного кислорода необходим расход электроэнергии в количестве 1,8—2,2 кВт на 1 м³ среды.

Температурные режимы в  ферментируемом субстрате дифференцированы: в фазе роста биомассы — 32—33 °С, в фазе кислотообразования — 30—31 °С.

В зависимости от особенностей используемого  мутанта Aspergillus niger применяют разные варианты технологических режимов глубинной технологии.

 

 

1. ХАРАКТЕРИСТИКА КОНЕЧНОЙ ПРОДУКЦИИ ПРОЕКТИРУЕМОГО ПРОИЗВОДСТВА

 

1.Техническое наименование  продукта – лимонная кислота  (чистота 99,9%).

2. Лимонная кислота  будет выпускаться в соответствии с требованиями      ГОСТ 908—79.

3.Лимонную кислоту  получают из культуральной жидкости  при глубинном культивировании микроскопического гриба Aspergillus niger с последующим отделением биомассы.

 

Химические  показатели лимонной кислоты
	Нормы для сортов
Показатели
	экстра	высший	первый
Массовая   доля   лимонной   кислоты   в пересчете на моногидрат, %
не менее	99,5	99,5               99,5
не более	101,0	Не нормируется
Цвет,   единицы   показателя   цветности	4	6                    10
раствора йодной шкалы, не более
Массовая доля, %, не более
золы	0,07	0,10                0,35
свободной серной кислоты	0,01	0,01                 0,03
мышьяка	0,00007	0,00007           0,00007
Проба
на свинец, медь,   цинк,   олово  с се-	Выдерживает анализ
роводородом
на оксалаты с ацетатом кальция		То же
на барий с серной кислотой		»
на ферроцианиды с  хлорным железом	Выдерживает	»
	анализ	Не нормируется
на сульфаты с хлоридом бария
Массовая  доля  сульфатной  золы,   %,	0,1	То же
не более
Проба   на   легкообугливающиеся    ве-	Выдерживает ана	лиз                 »
щества с серной кислотой
Проба на  железо  с   1,10-фенантроли-	То же	»
яом

 

Лимонная кислота по качеству должна соответствовать показателям, предусмотренным ГОСТ 908—79 . Это должны быть бесцветные кристаллы или белый порошок, без "комков, для кислоты I сорта допускается желтоватый оттенок, вкус кислый, без постороннего привкуса, 2%-ный раствор кислоты в дистиллированной воде должен не иметь запаха, быть прозрачным и не содержать механических примесей, структура —сыпучая, сухая, наощупь не липкая, без посторонних примесей.

За рубежом лимонную кислоту классифицируют по величине кристаллов на ситовых аппаратах. Большое  внимание обращают на легкообугливающиеся  вещества, дающие окраску при нагревании в течение определенного времени с концентрированной серной кислотой при температуре 90 °С. Они вызываются следами органических соединений — сахара, оксиметилфурфурола, других альдегидов и спиртов, за исключением цис- и трансаконитовой, изолимонной, щавелевой, янтарной и олеиновой кислот, эритрита, ксилита и сорбита  [93].

Для удаления легкообугливающихся  веществ предложено много способов: выделение цитрата кальция в  присутствии 10 % пероксида водорода к количеству лимонной кислоты; нагревание до кипения растворов лимонной кислоты после отделения гипса в сочетании с обработкой пероксидом водорода; добавление к раствору лимонной кислоты перед кристаллизацией борной кислоты в количестве 0,1—0,3 % по массе раствора, экстракция фреоном и др.

^Наиболее эффективным  способом очистки кристаллов  лимонной кислоты от'всех примесей является перекристаллизация. Лимонная кислота сорта экстра по всем показателям и нормам соответствует данным Британской фармакопеи 1968 г.

Лимонная кислота выпускается  только в упакованном виде: реализуемая  через розничную сеть —в мелкой фасовке массой нетто 10—100 г; предназначенная для предприятий пищевой и других отраслей промышленности — в крупной фасовке массой нетто 10—40 кг. При фасовке допускаются отклонения по массе нетто, не превышающие при массе до 50 г ±4 %, от 50 до ПО г +3 %. При упаковке кислоты в ящики и мешки допускаются отклонения, не превышающие ±0,5 %.

Мелкая фасовка должна проводиться в пакеты из «пищевой»  нестабилизи-рованной полиэтиленовой пленки марки Н, толщиной не менее 0,08 мм; из эти-кетировочной бумаги односторонней гладкости, ламинированной с внутренней стороны полиэтиленом высокого давления или пачки из бумаги марки Е по ГОСТ 7247—73 с внутренним вкладышем из подпергамента марки П-3. Пакеты и пачки оформляют красочными рисунками и надписями (товарный знак или «аименование предприятия-изготовителя и его подчиненность, наименование продукции и ее сорта, дата выработки, масса нетто, цена, обозначение настоящего стандарта). Пакеты и пачки с кислотой должны упаковываться в ящики из гофрированного картона № 13 массой нетто не более 10 кг.