В работе исследовались спектры
УФ поглощения, люминесценции и
её возбуждения для исходных состояний
содержащих тиминовые хромофоры систем
(водные растворы тимина; два типа кристаллов тимина
- безводный и кристаллогидрат, и полученные
из них слои; водные растворы политимидиловой кислоты
(poly-T)), а также кинетика их изменения в
результате фотопроцессов, вызываемых
УФ облучением. По кинетике спада люминесценции
твёрдых слоев тимина под действием УФ
облучения определялись квантовые выходы
фотодимеризации. Регистрация спектров
люминесценции, её возбуждения, а также
- поглощения (по однолучевой схеме) проводились
с использованием спектрофлуориметра
"Хита-чи-850" (с автоматической коррекцией
спектров).
В результате проведённых исследований
удалось получить ряд новых результатов:
1) Впервые показано, что
противоречия в литературных
данных по спектрам люминесценции
и её возбуждения водных растворов
тимина при комнатной температуре
связаны с накоплением в образцах
при люминесцентных измерениях
фотопродуктов с относительно
высокими квантовыми выходами
люминесценции (фотоаддуктов).
2) Впервые проведено исследование
спектров люминесценции двух
типов кристаллов тимина (безводного
и кристаллогидрата), а также спектров
поглощения, люминесценции и её
возбуждения полученных из них
слоев на кварце. Для слоёв
кристаллогидрата обнаружены фракции
с экситонным расщеплением спектров
поглощения -4000 см"1 и относительно
высокой фотохимической активностью.
Для двух типов слоёв впервые
определены квантовые выходы
фотодимеризации тимина.
3) Подробно исследованы
спектры люминесценции и впервые
исследованы спектры её возбуждения
водных растворов политимидиловой
кислоты при комнатной температуре.
Выявлены две не описанные
ранее полосы люминесценции, отнесённые
к невзаимодействующим хромофорам
и большим агрегатам. Впервые получены
поэтапные разностные спектры поглощения
водных растворов политимидиловой кислоты
в процессе их УФ облучения и показано,
что их фотохимическая активность в значительной
мере обязана двум типам стопочных димеров
с плотной упаковкой и экситонным расщеплением
спектров поглощения -4000 см"1.
4) Впервые исследована
многократная воспроизводимость
обратимой фотодимеризации в
водных растворах политимидиловой
кислоты при комнатной температуре
с целью оценки её применимости
для записи информации и показано,
что неполнота обратимости 6 фотодимеризации
обязана побочным фотохимическим
реакциям: образованию фотоаддуктов
и фототримеров.
Возвращаясь к ранее высказанному
тезису о принципиальной возможности
использования обратимой циклобутановой
димеризации для записи информации, на
основании полученных данных можно сделать
выводы о практической осуществимости
этой идеи. Как показывают литературные
и полученные нами данные, обратимость
циклобутановой димеризации, а соответственно
- её применимость для записи информации,
ограничивается параллельным ей накоплением фотоаддуктов.
Поиск путей с одной стороны - повышения квантовых выходов
циклобутановой фотодимеризации, а с другой
стороны - ингибирования побочной по отношению
к ней фотохимии, должен стать целью дальнейших
исследований.
Основные результаты работы
1) Показано, что водные
растворы тимина люминесцентно
гомогенны - спектры их люминесценции имеют
л4Пах=330 нм, а спектры её возбуждения с
лтах=266 нм совпадают со спектрами поглощения.
Противоречия в литературных данных по
их люминесценции объяснены фотохимическими
реакциями, ведущими к накоплению в образцах
в процессе измерения относительно хорошо
люминесцирующих примесей (фотоаддуктов).
2) Впервые исследованы
спектры люминесценции различных
кристаллических форм тимина (безводного
и кристаллогирата), а также спектры
люминесценции и её возбуждения
полученных из них слоев. В
полученных из кристаллогидрата
тимина слоях обнаружены спектральные
проявления существования парных
агрегатов с экситоннымрасщеплением
спектров поглощения -4000 см"1 и относительно
высокими квантовыми выходами
фотодимеризации.
3) Определён квантовый выход
циклобутановой димеризации тимина для
слоев, полученных из его безводных кристаллов равный
0,07, а из кристаллогидрата - 0,10.
4) В водных растворах политимидиловой кислоты,
по динамике изменения спектров поглощения
под действием ультрафиолетового облучения,
выявлено: а) два типа фотохимически активных
парных агрегатов - первого, с полосами
поглощения у 260 и 290-295 нм (с экситонным
расщеплением -4000см"1), и второго, с полосами
поглощения у 250 и 280-285 нм (экситонное расщепление
-4300 см"1); б) относительно инертная фотохимически
фракция изолированных тиминовых хромофоров
с максимумом полосы поглощения у 270 нм.
5) В спектрах люминесценции
водных растворов политимидиловой
кислоты наблюдались полосы с
максимумами у 320, 340 и 350-355 нм (две
из них, 320 и 350-355 нм - впервые), которым
сопоставлены: а) первой - изолированные
тиминовые хромофоры с максимумом
поглощения у 270 нм; б) второй - парные
агрегаты первого и второго
типа, выявленные нами по динамике
изменения форм спектров поглощения
под действием УФ облучения; в)
третьей - фотохимически инертные
агрегаты, состоящие из относительно
большого количества хромофоров,
с выявленными по спектрам
возбуждения люминесценции полосами
поглощения у 240-245 и 305 нм (экситонное
расщепление -8000 см"!).
6) В твёрдых слоях тимина
и в водных растворах политимидиловой
кислоты параллельно циклобутановой фотодимеризации
по динамике изменения спектров поглощения
и люминесценции наблюдалось образование
фотоаддуктов и реакция обратимой фототримери-зации
тимина, ограничивающие обратимость циклобутановойфотодимеризации.
По падению при облучении полосы люминесценции
фотоаддуктов определены квантовые выходы
фототримеризации в твёрдых слоях тимина
(от 0,01 до 0,04 - в зависимости от состояния
слоя) и водных растворах политимидиловой
кислоты (-0,01).
7) В твёрдых слоях тимина
и в водных растворах политимидиловой
кислоты люминесцентными методами
наблюдался перенос энергии между
разными фракциями тиминовых
хромофоров и с тиминовых хромофоров
на образующиеся в процессе
облучения фотоаддук-гы.
Люминесцентная микроскопия
Люминесцентная микроскопия — оптическое исследование
микрообъектов, окрашенных специальными
красителями (флюорохромами), испускающими
свечение при воздействии ультрафиолетовыми
лучами. Для люминесцентной микроскопии
применяются специальные оптические устройства
и микроскопы, основной частью которых
является источник ультрафиолетовых лучей
и система фильтров к нему.
Флюорохромы,
как правило, флюоресцируют по-разному
в зависимости от химического состава
структур, с которыми они взаимодействуют.
Некоторые из них обладают сродством к
определенным клеточным структурам. Например,
акридиновый оранжевый краситель окрашивает
нуклеопротеиды клетки, аурамин — воскоподобное
вещество, содержащееся в микобактериях.
Некоторые микрообъекты не требуют предварительной
окраски флюорохромами и изучаются с помощью
люминесцентной микроскопии без окраски.
Люминесцентная
микроскопия (флюоресцентная микроскопия)
— специальный вид микроскопирования,
основанный на использовании собственной
(первичной) или наведенной (вторичной)
фотолюминесценции микроскопических
объектов. Видимая люминесценция препарата
возбуждается либо сине-фиолетовым светом,
либо ультрафиолетовыми лучами.
Люминесцентный микроскоп в принципе
— обычный биологический микроскоп, снабженный
двумя светофильтрами: один пропускает
только возбуждающие сине- или ультрафиолетовые
лучи (его помещают перед источником света),
другой поглощает эти лучи и пропускает
только более длинноволновый свет люминесценции
препарата (его устанавливают в тубусе
или на окуляре микроскопа). Источниками
света служат ртутно-кварцевые лампы сверхвысокого
давления или лампы накаливания точечного
типа. Яркое цветное свечение объектов
на темном фоне обеспечивает высокий контраст.
Оптико-механическая промышленность выпускает
специальные люминесцентные микроскопы
и отдельные осветители.
Лишь немногие
биологически значимые вещества имеют
выраженную собственную люминесценцию
в видимой области спектра. К ним относятся
некоторые пигменты (хлорофилл, порфирины,
липохромы), витамины А и В2, алкалоиды
(берберин, хинин и др.), антибиотики (тетрациклины
и др.), химиотерапевтические и токсические
вещества. Проникновение этих веществ
в органы и клетки, их распределение и
превращения могут быть прослежены при
помощи прижизненной люминесцентной микроскопии.
Чаще в люминесцентной микроскопии используют
люминесцентную «окраску» специальными
веществами (флюорохромами), избирательно
придающими тонким структурам клетки
и тканей способность люминесцировать
(люминесцентная цитохимия). Так, например,
флюорохром акридиновый оранжевый применяют
для контрастирования ядерных структур,
выявления нуклеиновых кислот, мукополисахаридов,
для обнаружения микробов и крупных вирусов,
для цитодиагностики, в том числе распознавания
в мазках раковых клеток; аурамин 00 служит
для выявления кислотоустойчивых бактерий
(туберкулеза, проказы), риккетсий и некоторых
вирусов; примулин — для флюорохромирования
элементарных телец вирусов и различения
живых и мертвых клеток; фосфин ЗК, нильский
голубой и бензпирен — для локализации
липидов в клетках.
Особое значение в люминесцентной микроскопии
придается люминесцентно-иммунологическим
методам, основанным на применении люминесцентно
меченных специфических сывороток (антител).
Метчиком чаще служит флюорохром изотиоцианат
флюоресцеина. Получаемый комплекс «антитело-флюорохром»
позволяет быстро обнаруживать, идентифицировать
и локализовать даже ничтожные количества
соответствующих антигенов, в том числе
вирусов, риккетсий, бактерий на фоне посторонней
микрофлоры, а также выявлять специфические
белки, ферменты, полисахариды в клетках
и тканях. Наряду с визуальными наблюдениями
и фотографированием в люминесцентной
микроскопии все шире применяется объективная
регистрация интенсивности, спектров
и выхода люминесценции.
В СССР
развивается новый вид люминесцентная
микроскопия— так называемая ультрафиолетовая
Л.м., при помощи которой исследуется собственная
ультрафиолетовая невидимая в обычных
условиях люминесценция объектов, тонко
отражающая особенности их физиологического
состояния.
Люминесцентная микроскопия клеток и
тканей. При люминесцентной микроскопии
можно изучать первичную (ткани и органы
человека и животных имеют нерезкую белесую,
голубую или синюю люминесценцию) и вторичную
люминесценцию клеток и тканей. Изучение
вторичной люминесценции живых и фиксированных
клеток и тканей (после их «окраски» флюорохромами)
получило широкое распространение. При
изучении живых клеток флюоресцирующие
вещества применяют в очень малых количествах,
не вызывающих токсического действия.
В цитологических исследованиях Л. м. применяют
при диагностике злокачественных новообразований
в соскобах, пунктатах, мокроте, промывных
водах. Этот метод позволяет быстро получить
ярко окрашенный препарат, в котором атипичные
клетки выделяются ярким свечением, оттенками
цвета и структурой применяется и в гистохимии.
Использование акридинового оранжевого
позволяет выявить нуклеиновые кислоты,
при этом ДНК дает зеленую, а РНК — красную
флюоресценцию. Тот же флюорохром в нефиксированных
срезах помогает выявить мукополисахариды,
а при модификации этого метода — муцины.
Фосфин 3R, родамин В, бензпирен и др. выявляют
в срезах липиды.
ЛЮМИНОФОРЫ
(от лат. lumen, род. падеж luminis - свет
и греч. phoros - несущий), синтетич. в-ва,
способные преобразовывать разл.
виды энергии в световую - люминесцировать.
По типу возбуждения подразделяются
на фото-, катодо-, электро-, рентгено-,
радио-, хемилюминофоры и др.
Неорганические люминоформы(фосфоры). Их
свечение могут быть обусловлено как свойствами
вещества основы, так и наличием примесей
- активаторов, которые образуют в основном
веществе центры свечения, соактиватора
и сенсибилизатора. Концентрация активатора
обычно составляет 10-1-10-3%. Существуют самоактивирующие
люминоформы, не содержащие активаторов,
напр. CaWO4. Л. обозначают формулой основы с
указанием активатора и сенсибилизатора,
часто соактиватора, напр. ZnS : Ag, Ni; вещество
после знака ":" - активатор, соактиватор
или сенсибилизатор. Большинство неорганические
люминофоры имеет кристаллическую структуру
и относятся к кристаллофосфорам. Требования к
люминофорам - яркость и цвет свечения,
длительность послесвечения, дисперсность, термостойкость и др. - определяются
параметрами устройств, в которых их применяют.
Люминофоры обычно используют в виде относительно
тонких поликристаллических слоев (1-100
мкм), наносимых на внутреннюю поверхность
светящихся - экранов электровакуумных
приборов. Состав некоторых фото- и катодолюминофоров
и области их применения представлены
в таблице. Фотолюминофоры возбуждаются
оптическим излучением в диапазоне от
вакуумной УФ до ближней ИК области, наиболее
широкое применение фотолюминофоры находят
в люминесцентных лампах низкого давления.
В лампах для общего освещения используют
галофосфат Са -3[Са 3 (РО 4)2].Са(Сl, F)2 : Sb, Mn, в лампах высокого давления
с исправленной цветопередачей - смеси
на основе фосфатов и силикатов, излучающие
в синей, зеленой и красной областях спектра.
Свечение возбуждается резонансной линией
Hg с l =253,7 нм. Световая отдача (отношение
светового потока лампы к мощности) ламп
с галофосфатным дюминофором составляет
85 Лм/Вт, ламп со смесями - от 50 до 60 Лм/Вт.
Созданы лампы "нового поколения"
с люминофором на основе РЗЭ (алюминаты, фосфаты и др.), сочетающие
высокую светоотдачу (~ 95 Лм/Вт) с высоким
качеством цветопередачи. Фотолюминофоры
применяют для исправления цветности
ламп высокого давления, ламп, излучающих
в УФ области, и т. д. (см. табл.). Катодолюминофоры
возбуждаются пучком электронов; используются
в экранах кинескопов, в электронных микроскопах,
электроннолучевых и радиолокационных
установках. В кинескопах цветного изображения
применяют люминофоры с синим (l макс 455 нм), зеленым (l макс 525 нм) и красным (l макс 612 и 620 нм) цветом свечения. Их
наносят на экран кинескопа в виде точек,
расположенных треугольником, или чередующихся
полос. Суммарный цвет изображения получается
при сложении трех цветов свечения нанесенных
люминофор и зависит от соотношения их
яркостей. Для получения хорошей цветопередачи
цвет свечения исходных люминофоров должен
быть по возможности более насыщенным,
для чего поверхность "синего" Л.
пигментируют СоАl2 О 4, а "красного" - Fe2O3.
* При напряжении 6 кВ. ** При напряжении
14 кВ. *** При напряжении 12 кВ.