Биотестирование токсичности промышленных стоков производства химфармпрепаратов

М.А. Марынова (ст. преподаватель), К.Р. Таранцева (д.т.н., профессор)

БИОТЕСТИРОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ ПРОИЗВОДСТВА ХИМФАРМПРЕПАРАТОВ

г. Пенза, Пензенская государственная технологическая академия

 

Критерием определения  класса опасности  стока (2) является степень его вредного воздействия на окружающую природную среду при непосредственном или опосредованном воздействии на неё. Методологически для определения опасности стока используется расчётный или экспериментальный метод.

Расчётный метод предполагает суммировать показатели опасности веществ, содержащихся в сточных водах. Перечень компонентов отхода и их количественное содержание устанавливаются по составу исходного сырья и технологическим процессам его переработки или по результатам количественного химического анализа (2).

Производство антибиотиков - сложный технологический процесс,  включающий стадии биосинтеза, фильтрации, выделения, очистки целевого продукта. Многостадийность производства обуславливает  использование обширной номенклатуры сырья, неорганических и органических реагентов, и, как следствие, - образование многокомпонентных по составу   технологических сточных вод (рис.1). Степень их загрязнения оценивается с помощью количественных химических и физико-химических методов, при этом, содержание каждого из компонентов определяется отдельно, что не позволяет получить  комплексное представление о потенциальной опасности тех или иных технологических стоков.

Экспериментальный метод  основан на биотестировании.

Биологические методы позволяют получить информацию об отклонении водной среды от жизненного оптимума, позволяя  оценить стоки в целом, с учётом присутствия и взаимодействия в них как основных, так и минорных компонентов, содержание которых в изучаемых пробах может достигать нескольких десятков и определение каждого из них методически трудоёмко, невозможно или нецелесообразно (4). Таким образом, методы биотестирования – необходимое звено в оценке кумулирующего, аддитивного, антагонистического и генетического эффекта присутствующих в сточной воде химико-фармацевтического производства  соединений (3).

Как правило, стоки химико-фармацевтического  производства  обезвреживаются на биологических очистных сооружениях (БОС). В этой связи, несомненный интерес  также представляет использование  биотестов при выборе методов очистки сточных вод и оценки эффективности работы очистных сооружений.

При биотестировании СВ (3) производства антибиотиков необходимо решить две  задачи:

- подбор тест-объектов;

- выбор критериев интерпретации  данных биотестов.

Сложность в проведении биотестов заключается в том, что нет  стандартизированных для всех поллютантов методик с использованием  единого тест – объекта  и единого критерия  оценки проявления тест-реакции (6). Токсичность определяется   по тест – объектам различных систематических групп (дафнии и инфузории, цериодафнии и бактерии или водоросли и т.п.), проявившим более высокую чувствительность к анализируемому отходу (2). Таким образом, актуальным  является  подбор условий оценки токсичности сточных вод для каждого конкретного производственного процесса.

МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования являлось изучение возможности дифференциальной оценки токсичности сточных вод  на стадии разработки пускового технологического регламента  опытного производства полусинтетических бета-лактамных антибиотиков на примере производства цинковой соли цефалоспорина С: отработанный нативный раствор, средне-пропорциональный сток и  модельные растворы с содержанием различных количеств ацетона перед их усреднением и поступлением  на биологические очистные сооружения.

Экспресс-методом для  выработки концепции оценки токсичности  технологических стоков, образующихся на  каждой из стадий производства, являлось биотестирование с использованием санитарно- показательных микроорганизмов Еscherichia coli, Streptococcus faecalis. Критерием оценки данных, полученных с использованием биотестов, служила общая выживаемость микробной флоры.

Предложенные тест - организмы  для оценки токсичности водной среды  представляют интерес в связи  с коротким циклом развития, апатогенностью, возможностью получения в любое время необходимого количества тест – культур,  невысокой стоимостью анализа (1). 

В эксперимент брались  свежевыделенные из природного водоёма  штаммы, не адаптированные к данным сточным водам, типичные по своим культуральным, морфологическим и биохимическим свойствам. Основой индикации токсичности технологических стоков  являлась оценка  стимуляции или угнетения процессов роста выбранных тест-микроорганизмов под действием испытуемых веществ.

Объем опытных смесей составлял 5 литров. Смеси выдерживались при комнатной температуре. Составы опытных смесей представлены в таблице №1.

 

 

Рис.1 Схема формирования сточных вод производства антибиотиков

 

 

Таблица 1.

Схема опытных смесей

N опытных смесей	Состав смесей
1	Автоклавированная природная вода - ацетон 0,2 г/л - Esherichia coli 20000 кол/мл
2	Автоклавированная природная вода - ацетон 0,4г/л -  Esherichia coli 20000 кол/мл
3	Автоклавированная природная вода - ацетон 0,8г/л -  Esherichia coli 20000 кол/мл
4	Автоклавированный средне-пропорциональный сток - Esherichia coli 20000 кол/мл
5	Автоклавированная природная вода - средне-пропорциональный сток производства Zn- соли цефалоспорина С (в разведении 1:200) - Esherichia coli 20000 кол/мл
6	Автоклавированный нативный раствор - Esherichia coli 20000 кол/мл
7-контроль для №1-6	Автоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл
8	Автоклавированная природная вода - ацетон  0,2 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл
9	Автоклавированная природная вода - ацетон  0,8 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл
10	Автоклавированная природная вода - ацетон 1,4 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл
11-контроль для №8-10	Автоклавированная природная вода - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

 

Продолжительность эксперимента определялась исходя из задачи изучения длительности выживания тест-организмов под влиянием химических ингредиентов сточных вод. Высевы проводили в трёх параллельных определениях. Количественное определение микробных колоний проводили мембранным методом, соответствующим общепринятым в практике микробиологического контроля качества вод. Объем фильтруемых проб выбирался с таким расчётом, чтобы на фильтрах получить не более 30 изолированных колоний. Фильтрацию проводили под вакуумом на аппаратах Зейтца с использованием стерильных мембран с диаметром пор 0,45 мкм.

Определение количества колоний  Esherichia coli

По окончании фильтрации фильтр в асептических условиях помещали  на чашку Петри со средой Эндо. Инкубацию проводили  при температуре 37⁰С в течение 48 часов, затем подсчитывали количество колоний.  При росте колоний, характерных для бактерий группы кишечной палочки (темно-красных с металлическим блеском и без блеска, красных, розовых с тёмным центром), выполняли окраску по Граму, оксидазный тест и индольный тест. Все колонии грамотрицательных микроорганизмов, дающие отрицательную оксидазную реакцию и положительную индольную реакцию, учитывали как колонии E.coli и подсчитывали их. За окончательный результат принимали среднее значение, полученное при трёх параллельных определениях.

Определение количества колоний  Streptococcus faecalis

Фильтры с посевами в  асептических условиях помещали  на модифицированную среду Сланеца-Бертли. Посевы инкубировали в течение 48 часов при температуре 37⁰С.  На модифицированной среде Сланеца- Бертли подсчитывали  колонии, характерные для энтерококков - выпуклые, с ровными краями, различной окраски: темно-вишневые, малиновые, розовые, светло-розовые, равномерно окрашенные или с темно-красным, нечетко оформленным центром. Как правило, все колонии, которые растут на этой среде, можно отнести к фекальным стрептококкам, имеющим индикаторное значение. Очень мелкие, плоские, на пределе видимости невооруженным глазом колонии не учитывали. Подтверждали принадлежность колоний к энтерококку после окраски по Граму и микроскопирования. Обнаружение в мазках грамположительных, полиморфных, со слегка заостренными концами клеток, соединенных попарно, являлось  основанием отнести  колонии к изучаемому виду. За окончательный результат принимали среднее значение, полученное при трёх параллельных определениях.

На основании полученных данных строили логарифмические  кривые зависимости количества микробных  колонийd в 1  мл ( lg n) от характера стока (см. таблицу 1) и времени роста (t).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В технологическом процессе получения бета-лактамных антибиотиков используются водно-ацетоновые растворы. Остаточные количества ацетона после отгонки из технологических маточников попадают в стоки производства.  Для оценки  влияния ацетона на тест-культуру Esherichia coli были проведены эксперименты с модельными растворами, содержащими различное количество ацетона (рис.2).

Рис.2. Влияние различных концентраций ацетона на тест-культуру Esherichia coli

 

Смесь 1- автоклавированная природная вода - ацетон 0,2 г/л - Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 2- автоклавированная природная вода - ацетон 0,4г/л -  Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 3- автоклавированная природная вода - ацетон 0,8г/л -  Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 7- автоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл

 

Анализ экспериментальных  данных показал, что ацетон в дозе 0,8 г/л обладает выраженным бактерицидным  действием на  тест-культуру Esherichia coli по сравнению с контролем. Полное отмирание    Esherichia coli  в опытной пробе произошло через 10 часов после внесения тест-объекта в опытную пробу, тогда как в контроле отмечен постоянный рост коли-индекса

На рисунке 3 представлены кривые выживания  тест-объекта Streptococcus faecalis в модельных растворах с содержанием ацетона 0,2г/л; 0,8г/л; 1,2г/л. Очевидно, что культура  Streptococcus faecalis менее чувствительна к присутствию ацетона в опытных пробах и, в связи с этим, её использование в качестве биотеста менее перспективно.

Рис.3. Влияние различных концентраций ацетона на тест-культуру Streptococcus faecalis

 

Смесь 8- автоклавированная природная вода - ацетон  0,2 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

Смесь 9- автоклавированная природная вода - ацетон  0,8 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

Смесь 10- автоклавированная природная вода - ацетон 1,4 г/л -  Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

Смесь 11- автоклавированная природная вода - Streptococcus faecalis 20000 кол/мл

 

Средне-пропорциональный сток является многокомпонентным по составу. Он состоит из стоков образующихся на вспомогательных и основных стадиях производственного цикла (рис.1) и содержит остаточные количества различных органических растворителей, неорганических реагентов, продукты деструкции органических веществ. В связи с этим, определение его токсичности  представляло особый интерес. В качестве тест-объекта использовали культуру Esherichia coli. Как видно из рисунка 4, средне-пропорциональный сток без разведения является остротоксичным. В первые два часа наблюдалась некоторая стимуляция роста. Но уже к шести часам культура Esherichia coli не высевалась. Таким образом, можно сделать вывод о необходимости проводить его разбавление перед отправкой на биологические очистные сооружения.

Рис.4. Влияние средне-пропорционального стока различной концентрации на тест-культуру Esherichia coli

 

Смесь 4- автоклавированный средне-пропорциональный сток - Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 5- автоклавированный природная вода - средне-пропорциональный сток производства Zn- соли цефалоспорина С (в разведении 1:200) - Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 7 - автоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл втоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл

 

Оценку результатов  влияния отработанного нативного раствора на тест-культуру Esherichia coli проводили по максимальному эффекту длительности выживания. Отработанный нативный раствор может содержать в своём составе остаточные количества компонентов питательной среды, часть из которых подверглась деструкции под воздействием ферментных систем продуцента, продукты лизиса самого продуцента, остаточные количества антибиотика и др. вещества. Дать качественную и количественную оценку всех составляющих отработанного нативного раствора не представляется возможным.  Анализ кривых выживания  выявил, что отработанный нативный раствор ускорил отмирание Esherichia coli по сравнению с контролем. Появление плато на кривой соответствует полной утилизации субстрата. Характер контрольной кривой выживания не отличается от опытной, однако, общее количество  высеянных колоний в контроле на один-два порядка выше, что свидетельствует об ингибирующем влиянии нативного раствора на выживаемость бактерий изучаемого вида.

 

Рис.5. Влияние отработанного нативного раствора на тест-культуру Esherichia coli

 

Смесь 6- автоклавированная природная вода -5% нативного раствора - Esherichia coli 20000 кол/мл

Смесь 7- автоклавированная природная вода - Esherichia coli 20000 кол/мл

ВЫВОДЫ

Информация, полученная в результате  биотестирования, является инструментом принятия экологически обоснованных технологических решений на этапе разработки опытно-промышленного регламента. Угнетение и (или) гибель тест-объекта идет через фазу стимуляции роста и функциональной активности. Степень угнетения роста напрямую зависит от степени потенциальной опасности стока для окружающей среды. Таким образом, оценка длительности выживания   тест- объекта  Escherichia coli может быть положена в основу экспресс-метода оценки  степени токсичности  многокомпонентных по  составу сточных вод производства цинковой соли цефалоспорина С.

На начальном этапе  разработки технологических схем производства,  одновременно с техническими решениями, позволяющими получать максимальный выход  и заданную химическую  чистоту целевого продукта, важно оценить  степень токсичности  стоков, образующихся на каждой из производственных стадий. Принятие решения о целесообразности использования того или иного вида сырья и технологий, должно базироваться на данных оценки  потенциальной опасности каждого из образующихся стоков, возможности его обезвреживания  и отрицательных последствиях попадания в общий сток предприятия. Это позволит сэкономить значительные ресурсы на разработку природоохранных мероприятий  при последующем освоении технологий  производства химико-фармацевтических препаратов.