Очевидно, что размеры молекул связаны  с их массами, но отнюдь не целиком  ими определяются. Это особенно важно  учитывать в случае макромолекул, размеры которых могут существенно  зависеть от плотности упаковки полипептидной или полинуклеотидной цепи. В ограничении свободы диффузии через пространственную сетку пор внутри гранул немалую роль может играть и форма молекулы. Очевидно, что сферическая глобула будет диффундировать иначе, чем молекула такого же объема, но вытянутая в виде палочки.

     Как во всех хроматографических разделениях  излишняя длина колонки приводит к размыванию пика (рис. 9).

Рис. 9. Уширение полос в колонке из-за чрезмерной длины колонки. Так называемая эффективная часть колонки является достаточной для разделения. Слишком длинные колонки не улучшают очистку, но вызывают разбавление образца из-за уширения полос.  

     Гель-фильтрационная хроматография является также вспомогательным методом для оценки молекулярной массы молекул. Несмотря на то, что для этого существуют гораздо более точные методы, например, масс-спектрометрия, гель-фильтрация оказывается полезной для измерения равновесий мономер-мультимер при микромолярных (мкМ) концентрациях биомолекул (рис. 10).

Рис.10. Молекулы с известной молекулярной массой дают возможность оценить молекулярную массу неизвестной молекулы. В данном случае для исследуемой молекулы наблюдаются два пика, что указывает на равновесие мономер-димер.Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускаются в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами пор. 

Г.Ионообменная хроматография

     Этот  процесс сходен с адсорбционной хроматографией в следствие того, что задержание молекул вещества в неподвижной фазе обусловлено их связыванием с поверхностью твердого гидрофильного материала сплошных или пористых гранул, находящихся в контакте с жидким элюентом. Однако в этом варианте хроматографии задержание происходит не за счет молекулярной адсорбции, а в результате электростатического   взаимодействия   разноименно   заряженных   ионов.

     На  всех   наружных и внутренних поверхностях твердых гранул  вдоль нитей полимеров и гелей, образующих пространственную сетку, более или менее равномерно распределены ковалентно связанные с этими поверхностями ионогенные группы. В омывающем их водном элюенте они диссоциируют, образуя сетку одноименно заряженных неподвижных ионов. Если молекулы компонентов фракционируемой смеси тоже способны ионизироваться при растворении, причем так, что их суммарный заряд имеет противоположный знак, то они связываются с неподвижными ионогенными группами силами электростатического взаимодействия, оказываясь тем самым фиксированными в неподвижной фазе. Связь эта обратима: ионы одних компонентов могут замещаться на другие или вытесняться находящимися в элюенте контрионамиионогенных групп сорбента, а также специально вводимыми для этой цели в элюент ионами. Происходит обмен ионов, поэтому сорбенты описанного типа называют  ионообменниками (ионитами).

     Выбор ионообменного сорбента  для очистки белка в значительной степени зависит от изоэлектрической точки белка — p_i. При значениях рН, превышающих p_i белка, его молекулы приобретают в целом отрицательный заряд и способны адсорбироваться анионнымобменником. При рН ниже p_i белок будет адсорбироваться катион-нымобменником. Например, если p_i = 4, то в большинстве случаев целесообразно подобрать сорбент, который способен связывать белок при рН > 4. Поскольку при рН > 4 такой белок заряжен отрицательно, то сорбент должен быть анионообменником, например, с диэтиламиноэтильной функциональной группой (ДЭАЭ). Можно было бы использовать рН < 4 и катионообменник, но многие белки в таких условиях нестабильны, либо образуют агрегаты. Если, напротив, белок, который мы хотим очистить, имеет pi = 10, то он будет заряжен положительно в условиях, пригодных, как правило, для ионообменной хроматографии, т. е. при рН около 7. Таким образом, в общем, для белка такого типа мы должны выбрать катионообменный сорбент, например, с карбоксиметильной функциональной группой (КМ), которая при нейтральном рН заряжена отрицательно.

     Адсорбирующая способность сорбента сильно зависит  от рН и от pi разделяемых белков (рис. 11), но также от качества сорбента, прилагаемого давления и от числа прогонов колонки. Чтобы увеличить срок службы сорбента, его следует тщательно промыть, хранить в подходящем растворителе и не применять рН и давление вне предписанных допустимых пределов.

Рис. 11. Зарядовые свойства анионо- и катионообменников. Анионообменник с ДЭАЭ имеет значительную емкость при низких и средних значениях рН=1-6; катионообменник с КМ имеет высокую емкость при высоких и средних значениях рН=6-14.  

     На  представленном рисунке показаны профили  сил удерживания т.н. "слабых" ионообменников, емкость которых  значительно зависит от рН подвижной  фазы. Также широко распространены "сильные" катионообменники, практически  не меняющие  свою емкость в широком диапазоне рН. В этих ионитах в качестве ионогенных групп используются или остатки сильных кислот (например, серной) в катионообменниках, или  сильные основания (например, четвертичные амины) в анионообменниках. В первом случае катионообменникимеет рабочий интервал рН равен 1-14, а во втором случае - 1-11. На практике при выборе силы обменника следует учитывать множество факторов, например, крупные белковые молекулы могут в неподходящих условиях необратимо связываться с "сильными" анионитами.

Разрешающая способность хроматографического разделения зависит преимущественно от типа биомолекул, типа и качества сорбента, ионной силы градиента при элюции, от температуры и от геометрии колонки.

     Как уже отмечалось, возможность фракционирования компонентов смеси веществ обусловлена  здесь различием в значениях  их суммарных зарядов. Последние  зависят как от числа и характера  ионогенных групп в молекулах, так  и от полноты их диссоциации, которую  можно контролировать путем выбора рН и ионной силы элюента. Чем больше в данных условиях элюции суммарный заряд того или иного компонента смеси, тем сильнее его взаимодействие с ионообменником и тем медленнее он мигрирует вдоль колонки. Так, на рисунке12 представлен пример разделения аминокислот, имеющих разный заряд.  

Рис.12 Разделение имеющих разный заряд аминокислот.

     На  очерченный здесь основной процесс  ионообменной хроматографии влияет ряд дополнительных факторов. Среди  них, кроме уже фигурировавшей ранее  затрудненной (особенно для крупных  молекул) диффузии внутри гранул, следует  назвать возможность неионной адсорбции  на поверхности матрицы ионообменника. Однако при правильном выборе материала  обменника, и в частности его  пористости, основную роль в процессе фракционирования играет явление ионного обмена.

Схема типичного прибора для ионообменной хроматографии представлена на рисунке  13.

Рис. 13 Типичная установка ионообменной жидкостной хроматографии для очистки белков. После загрузки образца насос создает солевой градиент для элюции образца.  

Д.Распределительная хроматография          

 Строго  говоря, так следует назвать хроматографическии  процесс, в котором неподвижная  и подвижная фазы представлены  двумя несмешивающимися или частично  смешивающимися жидкостями. Если  в системе двух контактирующих  между собой жидкостей такого  рода растворять какое-либо вещество, то его концентрация в этих  растворителях будет одинакова  только в том случае, если оба  они обладают одинаковой растворяющей  способностью, т. е. одинаковым  сродством к веществу. В противном  случае молекулы вещества будут  переходить из одной жидкости  в другую до тех пор, пока  не установится равновесие, которому  будет отвечать более высокая  концентрация этих молекул в  той жидкости, растворяющая способность  которой выше. Если такие жидкости  представляют собой неподвижную  и подвижную хроматографические  фазы, то распределение вещества  между фазами происходит в  соответствии с растворимостями  в них компонентов исходной  смеси, причем для каждого компонента  — независимо от всех других (если, разумеется, свойства самих  растворителей при этом не изменяются). Чем выше сродство данного компонента к неподвижной фазе, тем медленнее он мигрирует вдоль колонки или пластинки.        

 Жидкость  неподвижной фазы, как и при  гель-фильтрации, может быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, или, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, или же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них. Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции или химическим путем. В последнем случае нередко «пленка» жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы компонентов фракционируемой смеси в соответствии со степенью их сродства к нему. В этом случаео соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только понятиями «сродства» того или иного компонента к неподвижной и подвижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количественной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределительной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осуществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаимно насыщенными.         

 Очень  часто одна из фаз обогащена  органическим растворителем, в  то время как другая является  в основном водной. Естественно,  что в этом случае фракционирование веществ идет по степени их гидрофобности. Исторически сложилось так, что «нормальным» расположением фаз называют такое, при котором неподвижной является водная фаза. За счет смачивания (набухания) она легко фиксируется на гидрофильных матрицах (целлюлозе, полиакриламидном или декстрановом гелях, диатомовых землях, силикагеле и др.). В состав подвижной фазы в этом случае входят органические растворители. При обратном расположении фаз, когда на твердой матрице фиксируют пленку органического растворителя, а подвижная фаза представляет собой водный раствор, распределительную хроматографию называют хроматографией в обращенных фазах (ХОФ). В английской литературе ее обозначают RPC (reversedphasechromatography). ХОФ при высоком давлении нередко осуществляют таким образом, что неподвижная фаза вместо пленки органического растворителя представлена монослоем молекул жирного или ароматического ряда, химически закрепленных на поверхности твердой матрицы силикагеля. В качестве матриц для ХОФ с истинно жидкой неподвижной фазой часто используют предварительно силиконированные   диатомовые   земли   типа   кизельгуров.

1.3.Классификация по расположению неподвижной фазы

А.Колоночная хроматография

     Если  пористые гранулы геля или сорбента для любого типа хроматографии заполняют стеклянную или металлическую колонку, то говорят о хроматографии на колонке, или «колоночной хроматографии», хотя последнее выражение относится к категории укоренившегося жаргона. Хроматографию на колонке во многих случаях теперь ведут при очень большом давлении подачи элюента (до 300—400 атм), что позволяет уменьшить диаметр гранул до 5—10 мкм с вытекающими отсюда (см. ниже) существенными преимуществами в быстроте и качестве фракционирования микроколичеств исходного вещества. За это приходится расплачиваться использованием дорогостоящих стальных прецизионных колонок и специальной аппаратуры, но в случае серийных анализов такие затраты себя оправдывают. Жидкостную хроматографию на колонках при высоком давлении условимся сокращенно обозначать ЖХВД (ВЭЖХ). В английской литературе принято обозначение HPLC, которое расшифровывают как «highpressure   (иногда — high   performance)   liquid   chromatography». 

     Б.Тонкослойная хроматография

     Тонкий (0,1—0,5 мм) слой гранул, адсорбированных  или иным образом закрепленных на поверхности пластинки из стекла или пластика, позволяет осуществлять хроматографию в тонком слое, или «тонкослойную хроматографию» (ТСХ). Английское обозначение TLC (thinlayer chromatography). Движение жидкой фазы происходит   за   счет   капиллярных   сил (рис.14).

Рис 14. Принцип тонкослойной хроматографии.

     Тонкослойная  хроматография имеет несколько  способов, связанных, в основном, с  видом движения растворителей.

А. Восходящая тонкослойная хроматография

Б. Нисходящая тонкослойная хроматография