Источники и структура протеолитических ферментов

Для определения ферментативной активности протеиназ используют их способность гидролизовать белковый субстрат с образованием продуктов гидролиза — аминокислот, содержание которых затем определяется спектрофотометрически. Обозначение и величина единицы активности имеет прямую зависимость от используемого метода анализа, что включает физико-химические характеристики субстрата, температурный режим гидролиза, рН среды, время проведения гидролиза, а также многие другие факторы, влияющие на протеолитическую активность фермента.

В настоящее время большинство зарубежных производителей папаина и бромелайна используют условное обозначение единиц активности – наиболее широко распространено обозначение TU/mg (тирозиновые единицы), Unit/g, U, GDU/g и др., на территории РФ протеолитическую активность обычно обозначают в ЕД/г.

2. Характеристика и происхождения протеаз животного происхождения.

Протезы животного происхождения уже давно  и широко используются в пищевой промышленности. Представителями протеаз животного происхождения являются трипсин и пепсин.

К протеазам животного происхождения принадлежит огромная роль в процессах пищеварения. К важнейшим протеазам относятся трипсин, химотрипсин, пепсин, ренин. Трипсин и химотрипсин - протеазы поджелудочной железы, которая в виде неочищенного панкреатина находит некоторое применение в пищевой промышленности для производства гидролизатов. Высокоочищенный трипсин применяется для медицинских целей. Трипсин - эндогенный протеолитический фермент, разрывающий пептидные связи в молекуле белка. Расщепляет также высокомолекулярные продукты распада белков, полипептиды типа пептонов, а также некоторые низкомолекулярные пептиды, содержащие определенные аминокислоты (аргинин, лизин). Трипсин представляет собой белок с относительной молекулярной массой 21 000. Образуется в поджелудочной железе млекопитающих, где содержится в виде неактивного трипсиногена; переход последнего в трипсин происходит под влиянием другого фермента - энтерокиназы, а также под воздействием самого образовавшегося трипсина.

Пепсин, который вырабатывается слизистой желудка, входит в состав лекарственных ферментных препаратов. В пищевой промышленности пепсин используют (в комплексе с химозином в виде сычужного фермента) для свертывания казеина молока при производстве творога и сыра и для растворения белковой мути в пиве. Реннин - фермент, имеющий много сходства с пепсином, содержится в соке четвертого отдела желудка телят. Реннин представляет собой мощную протеазу, осуществляющую свертывание молока; он является основным компонентом неочищенных экстрактов и комплексных промышленных препаратов, используемых для этой цели. Казеин молока является фосфопротеидом, он не осаждается ионами Са2+; действие реннина приводит к образованию макрогликопептида и парα-χ-казеина. Последний осаждается в присутствии ионов Са2+ и способствует осаждению других фракций казеина.

3.3 Характеристика  и происхождение протеаз микробного  происхождения.

Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы. Активными продуцентами протеиназ являются бактерии, микроскопические грибы и актиномицеты. Можно назвать сотни микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, которые используются при промышленном получении протеиназ. Они чаще всего относятся к родам Bacillus, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Pseudomonas и некоторые другие.

Микробные протеазы – чрезвычайно разнообразны и широко применяются (на их долю приходится около 40% от всех используемых ферментов). Наибольшее применение нашли щелочная сериновая протеаза, которая используется в моющих средствах; грибная протеаза из Мусоr, которая заменила телячьи сычуги в производстве сыра, а грибная протеаза из A. oryzae (в комплексе с амилазой), используемая в хлебопечении.

Полифенолоксидаза может катализировать окисление моно-, ди-, и полифенолов. С действием этого фермента связано образование темноокрашенных соединений – меланинов при окислении кислородом воздуха аминокислоты тирозина (потемнение срезов картофеля, яблок, грибов и других растительных тканей). В пищевой промышленности основной интерес к этому ферменту сосредоточен на предотвращении указанного ферментативного потемнения, что может быть достигнута путем тепловой инактивации фермента (бланшировка) или добавлением ингибиторов (NaHSO3, SO2, NaCl).

Каталаза катализирует разложение пероксида водорода по реакции самоокисления-самовосстановления. В живом организме каталаза защищает клетки от губительного действия перекиси водорода. Хорошим источником для получения промышленных препаратов каталазы являются культуры микроорганизмов и печень крупного рогатого скота.

Липоксигеназа катализирует окисление полиненасыщенных высокомолекулярных жирных кислот (линолевой и линоленовой) кислородом воздуха с образованием гидроперекисей:

Липоксигеназе принадлежит важная роль в процессах созревания пшеничной муки, связанных с улучшением ее хлебопекарных достоинств. При этом происходит осветление муки, укрепление клейковины, снижение активности протеолитических ферментов и другие положительные изменения.

Глюкозооксидаза окисляет глюкозу с образованием глюконовой кислоты. Высокоочищенные препараты глюкозооксидазы получают из плесневых грибов рода Aspergillus и Penicillium.

Препараты глюкозооксидазы нашли применение в пищевой промышленности как для удаления следов глюкозы, что необходимо при обработке пищевых продуктов, качество и аромат которых ухудшаются из-за того, что в них содержатся восстанавливающие сахара; например, при получении из яиц сухого яичного порошка.

4. Иммобилизированные ферменты.

Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Кроме того, иммобилизация ведет к изменению свойств фермента: субстратной специфичности, устойчивости, зависимости активности от параметров среды. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов. Так, происходящая при температуре 65°С термоинактивация лактатдегидрогеназы, иммобилизованной в 60 %-м полиакриламидном геле, замедлена в 3600 раз по сравнению с нативным ферментом. Все перечисленное обеспечивает высокую экономичность, эффективность и конкурентоспособность технологий, использующих иммобилизованные ферменты.

 Идеальные материалы, используемые для иммобилизации  ферментов, должны обладать следующими  основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической  стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью как  для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко  активироваться (переходить в реакционноспособную форму).

 Естественно, ни один  из используемых в настоящее  время в качестве носителя  материал не отвечает полностью  перечисленным требованиям. Тем  не менее существует широкий  набор носи­телей, пригодных для  иммобилизации определенных энзимов в конкретных условиях.

 В зависимости от  природы носители делятся на  органические и неорганические материалы.

^ Органические полимерные  носители. Иммобилизация многих  ферментов осуществляется на  полимерных носителях органической  природы. Существующие органические  полимерные носители можно разделить  на два класса: природные и  синтетические полимерные носители. В свою очередь, каждый из классов  органических полимерных носителей  подразделяется на группы в  зависимости от их строения. Среди  природных полимеров выделяют  белковые, полисахаридные и липидные  носители, а среди синтетических  — полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.

 К преимуществам природных  носителей следует отнести их  доступность, полифункциональность  и гидрофильность, а к недостаткам  — биодеградируемость и достаточно  высокую стоимость.

 Из полисахаридов для  иммобилизации наиболее часто  используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные.

 Из природных аминосахаридов  в качестве носителей для иммобилизации  применяют хитин, который в значительных  количествах накапливается в  виде отходов в процессе промышленной  переработки крабов и креветок. Хитин химически стоек и имеет  хорошо выраженную пористую структуру.

 Среди белков практическое  применение в качестве носителей  нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и  продукт переработки коллагена  — желатина. Эти белки широко  распространены в природе, поэтому  доступны в значительных количествах, дешевы и имеют большое число  функциональных групп для связывания  фермента. Белки способны к биодеградации, что очень важно при конструировании  иммобилизованных ферментов для  медицинских целей. К недостаткам  белков как носителей в этом  случае следует отнести их высокую иммуногенность.

^ Синтетические полимерные  носители. Благодаря разнообразию  и доступности материалы этой  группы широко используются как  носители для иммобилизации. К  ним относятся полимеры на  основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные  и полиуретановые полимеры. Большинство  синтетических полимерных носителей  обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают  возможность варьирования в широких  пределах величины пор, введения  различных функциональных групп. Некоторые синтетические полимеры  могут быть произведены в различных  физических формах (трубы, волокна, гранулы). Все эти свойства полезны  для разных способов иммобилизации ферментов.

^ Носители неорганической  природы. В качестве носителей  наиболее часто применяют материалы  из стекла, глины, керамики, графитовой  сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать  химической модификации, для чего  носители покрывают пленкой оксидов  алюминия, титана, гафния, циркония  или обрабатывают органическими  полимерами. Основное преимущество  неорганических носителей — легкость  регенерации. Подобно синтетическим  полимерам неорганическим носителям  можно придать любую форму  и получать их с любой степенью пористости.

 Итак, к настоящему  времени создано огромное число  разнообразных носителей для  иммобилизации ферментов. Однако  для каждого индивидуального  фермента, используемого в конкретном  технологическом процессе, необходимо  подбирать оптимальные варианты  как носителя, так и условий и способов иммобилизации.

 Существуют два принципиально  различных метода иммобилизации  ферментов: без возникновения ковалентных  связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной  связи между ними (химические  методы иммобилизации). Каждый из  этих методов осуществляется разными способами.

^ Физические методы иммобилизации  ферментов реализуются посредством  адсорбции фермента на нерастворимом  носителе, путем включения энзимов  в поры поперечносшитого геля, в по­лупроницаемые структуры или двухфазные системы.

^ Адсорбция ферментов  на нерастворимых носителях. При  адсорбционной иммобилизации белковая  молекула удерживается на поверхности  носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей.

 Эффективность адсорбции  молекулы белка на носителе  определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и  пористостью носителя. Процесс адсорбции  ферментов на нерастворимых носителях  отличается крайней простотой  и достигается при контакте  водного раствора фермента с  носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим  способом с использованием колонок). С этой целью раствор фермента  смешивают со свежим осадком, например, гидроксида титана, и высушивают  в мягких условиях. Активность  фермента при таком варианте  иммобилизации сохраняется практически  на 100%, а удельная концентрация  белка достигает 64 мг на 1 г носителя.

 К недостаткам адсорбционного  метода следует отнести невысокую  прочность связывания фермента  с носителем. При изменении условий  иммобилизации могут происходить  десорбция фермента, его потеря  и загрязнение продуктов реакции. Существенно повысить прочность  связывания фермента с носителем  может предварительная его модификация (обработка ионами металлов, полифункциональными  агентами — полимерами, белками, гидрофобными соединениями, монослоем  липида и пр.). Иногда, наоборот, модификации  подвергается молекула исходного  фермента, однако зачастую это  ведет к снижению его активности.

^ Иммобилизация ферментов  путем включения в гель. Способ  иммобилизации ферментов путем  включения в трехмерную структуру  полимерного геля широко распространен  благодаря своей простоте и  уникальности. Метод применим для  иммобилизации не только индивидуальных  ферментов, но и мультиэнзимных  комплексов и даже интактных  клеток. Иммобилизацию ферментов  в геле осуществляют двумя  способами. В первом случае фермент  вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго — гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция.