Метод исследования - Электрофорез

Электрофорез  проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза  на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность  электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α₁ глобулины, α₂-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Ионообменная хроматография

Так же как и  электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммарным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твёрдым пористым заряженным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаимодействий.

В качестве неподвижной  фазы используют ионообменники - полимерные органические вещества, содержащие заряженные функциональные группы.

Различают положительно заряженные анионообменники, среди  которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

Выбор ионообменника  определяется зарядом выделяемого  белка. Так, для выделения отрицательно

Электрофорез  белков сыворотки крови здорового  человека на бумаге.

заряженного белка  используют анионообменник. При пропускании  раствора белка через колонку  прочность связывания белка с  анионообменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике, можно смыть (элюировать) буферными растворами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными функциональными группами анионообменника и вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постепенное увеличение концентрации соли или изменение рН, что меняет заряд белковой молекулы, приводит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок.

Аффинная хроматография, или хроматография  по сродству

Это наиболее специфичный  метод выделения индивидуальных белков, основанный на избирательном  взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, заполненную иммобилизованным лигандом, пропускают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные белки выходят с элюатом. Белок, адсорбированный на колонке, можно снять, промыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разрывающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография  отличается высокой избирательностью и помогает очистить выделяемый белок  в тысячи раз.

Аффинная  хроматография.

Очистка белков от низкомолекулярных примесей

Для удаления низкомолекулярных  соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют  диализ. Метод основан на том, что  через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу. В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки  белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации.

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления. От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции). Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты - это  биополимеры, макромолекулы которых состоят из многократно повторяющихся звеньев - нуклеотидов. Поэтому их называют также полинуклеотидами. Важнейшей характеристикой нуклеиновых кислот является их нуклеотидный состав. В состав нуклеотида - структурного звена нуклеиновых кислот - входят три составные части:

· азотистое основание - пиримидиновое или пуриновое. В нуклеиновых кислотах содержатся основания 4-х разных видов: два из них относятся к классу пуринов и два - к классу пиримидинов. Азот, содержащийся в кольцах, придает молекулам основные свойства.

· моносахарид - рибоза или 2-дезоксирибоза. Сахар, входящий в состав нуклеотида, содержит пять углеродных атомов, т.е. представляет собой пентозу. В зависимости от вида пентозы, присутствующей в нуклеотиде, различают два вида нуклеиновых кислот - рибонуклеиновые кислоты (РНК), которые содержат рибозу, и дезоксирибонуклеиновые кислоты (ДНК), содержащие дизоксирибозу.

· остаток фосфорной  кислоты. Нуклеиновые кислоты являются кислотами потому, что в их молекулах  содержится фосфорная кислота. Нуклеотид - фосфорный эфир нуклеозида. В состав нуклеозида входят два компонента: моносахарид (рибоза или дезоксирибоза) и азотистое основание.

MultiNA - Система электрофореза  на микрочипе для исследования  нуклеиновых кислот

Сочетание технологии электрофореза на микрочипе, автоматизированной пробоподготовки и чувствительного флуориметрического детектирования предлагает высокоэффективную замену традиционному агарозному гель-электрофорезу. Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот становится теперь как никогда быстрым, недорогим и высокоточным. В настоящее время при проведении исследований нуклеиновых кислот основным методом изучения распределения фрагментов ДНК и РНК по молекулярной массе (размеру) остается агарозный гель-электрофорез. К основным недостаткам этого метода следует отнести достаточно высокую стоимость анализа при использовании готовых пластин геля, высокую трудоемкость, связанную с большим количеством ручных операций, длительность анализа, необходимость использования дополнительного весьма дорогостоящего оборудования для визуализации и последующей цифровой обработки электрофореграмм, использование небезопасных для здоровья реагентов (бромистого этидия). Всех этих недостатков лишена последняя разработка компании Shimadzu – прибор для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с использованием микрочипа MCE®-202 MultiNA.

Основные преимущества системы  электрофореза на микрочипе:

• Низкая стоимость анализа. Конструкция и материал микрочипа позволяют использовать его для нескольких тысяч анализов, при этом используется крайне незначительное количество расходных материалов. Тем самым достигается существенное снижение стоимости (в 1,5 – 3 раза) одного анализа ДНК по сравнению с агарозным гель-электрофорезом. Если сравнивать систему электрофореза на микрочипе с существующими сейчас на рынке системами капиллярного электрофореза, то снижение стоимости анализа может достигать 6 и более раз. В случае анализа РНК экономия может быть еще более существенной (рассчитано, исходя из стоимости оборудования и реагентов на японском рынке).
• Высокая скорость анализа. Высокоскоростной автоматизированный анализ до 108 образцов (96 + 12 дополнительно). С использованием одного микрочипа полный цикл анализа ДНК составляет 255 секунд. Для увеличения производительности в прибор может быть установлено до четырех микрочипов для параллельной работы. В этом случае время одного анализа сокращается до 75 секунд.
• Высокая чувствительность. Флуориметрический детектор с фотоумножителем и источником возбуждения флуоресценции на основе светодиода обеспечивает примерно 10-кратное увеличение чувствительности по сравнению с традиционным окрашиванием бромистым этидием (данные получены в ходе внутренних испытаний в лаборатории Shimadzu). К тому же используемые флуоресцентные красители, такие как SYBR green II и SYBR gold, абсолютно безвредны для здоровья в отличие от бромистого этидия.
• Высокое разрешение и прекрасная воспроизводимость анализа. Оптимальная конфигурация капилляров микрочипа и специально подобранный состав буферного раствора обеспечивают превосходные характеристики электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Благодаря автоматизированной системе пробоподготовки количество ручных операций сведено к минимуму. Внутренние маркеры молекулярного веса уже включены в наборы реагентов и используются при каждом анализе. Все это в комплексе существенно увеличивает надежность и воспроизводимость получаемых результатов. Прибор может комплектоваться четырьмя различными наборами реагентов для анализа ДНК разного размера и РНК
• Простота использования. Программное обеспечение с дружественным пользовательским интерфейсом и большим количеством функций максимально упрощает проведение исследования. Оператору достаточно загрузить образцы и реагенты в прибор, задать в программе желаемую последовательность анализа образцов и кликнуть по иконке «Старт» на экране компьютера. Все остальное, включая обработку электрофореграмм, прибор выполнит в автоматическом режиме.

 Микрочип MultiNA

Микрочип, изготовленный  из кварца высокой чистоты, включает микроемкости для загрузки образца и реагентов и электрофоретический канал 23 × 0,09 × 0,05 мм (д ×ш × г). Напряжение подается при помощи напыленных платиновых электродов. Канал и микроемкости выполнены с высочайшей точностью при помощи уникальной фотолитографической технологии Shimadzu. Специальное покрытие обеспечивает возможность многократного использования одного и того же микрочипа (~ 3600 анализов). Следствием малой длины электрофоретического канала и его оптимальной формы является непревзойденная на сегодняшний день скорость электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Наборы реагентов для анализа ДНК и РНК. Прибор может комплектоваться тремя наборами реагентов для анализа ДНК различного размера и набором реагентов для анализа РНК.