Модификация поверхности наночастиц меркаптокислотами с различной длиной углеводородного радикала

В 1993 г. Бавенди с соавт. [6], используя высокотемпературный органометаллический синтез, синтезировали хорошо люминесцирующие квантовые точки из CdSe.

Типичная технология синтеза CdSe нанокристаллов заключается в следующем. Диметил кадмия и селеновую пудру, растворенную в триалкилфосфине (бутиле или октиле) впрыскивают в горячий (340—360°С) триоктилфосфин оксид (ТОФО) технической чистоты 90%) [1]. В результате при температуре 280—300°С формируются зародыши нанокристаллов. Молекулы растворителя адсорбируются и десорбируются с поверхности растущих нанокристаллов, обеспечивая осаждение (или удаление) атомов кристалла. Агрегация подавляется постоянным присутствием на поверхности нанокристаллов монослоя атомов растворителя.

В связи с тем, что приготовленные методами органометаллического высокотемпературного синтеза квантовые точки являются гидрофобными, очередным необходимым этапом в их применении в биологических науках явилась разработка технологий их перевода в водную фазу, стабилизации и конъюгации с белками, пептидами и нуклеиновыми кислотами. Первой такой технологией стало заключение нанокристаллов в дополнительный кремниевый или силоксановый слой толщиной 1—5 нм, содержащий на своей поверхности тиольные, аминогруппы или карбоксильные группы, обработка поверхности меркаптокислотами, заключение их в фосфолипидные мицеллы либо заключение нанокристаллов в дополнительную органическую оболочку из би- или трифункциональных полимеров, способных связываться с поверхностью наночастиц, обеспечивать их растворимость в водной фазе за счет полярных групп и содержащих дополнительные функциональные группы, доступные для конъюгации [1].

Технология перевода нанокристаллов в водную фазу.

Синтезируемые CdSe/ZnS нанокристаллы покрыты слоем ТОФО (и другими лигандами) и растворимы только в органических растворителях (хлороформ, толуол, гептан и т.п.). Их использование в биологических средах требует изменения свойств поверхности, формирования на поверхности частиц гидрофильных групп, часть из которых могла бы далее быть спейсером для присоединения к ним биологических молекул. К настоящему времени опубликовано много работ, посвященных методам солюбилизации нанокристаллов. По существу, во всех этих работах реализуются три основных подхода: (1) использование бифункциональных соединений, способных замещать молекулы ТОФО и содержащие гидрофильные группы, которые после присоединения к нанокристаллам оказываются экспонированными в раствор и обеспечивают водорастворимость; (2) формирование полимерного слоя вокруг нанокристалла за счет проникновения гидрофобных фрагментов солюбилизирующих агентов в оболочку ТОФО без удаления молекул ТОФО с поверхности нанокристаллов и (3) внедрение полупроводниковых нанокристаллов в полимерные микрочастицы (микросферы или микрокапсулы).

 

Перевод нанокристаллов в водную фазу методом замещения ТОФО бифункциональным лигандами.

Метод основан на непосредственной адсорбции бифункциональных лигандов, способных связываться с поверхностными атомами цинка или серы через тиольные или фосфиновые группы таких соединений, как меркаптокислоты, цистеин и т. п., а также через SH-группы, введенные методом химической модификации в молекулы этиленгликоля, ДНК, белков или пептидов [1]. Раствор лигандов добавляют к покрытым молекулами ТОФО нанокристаллам в хлороформе. Связывание атомов серы с поверхностными ионами цинка или серы приводит к замещению молекул ТОФО на солюбилизирующие лиганды. В результате нанокристаллы выпадают в осадок из органического растворителя, но становятся растворимыми в воде.

Недостатком описанного метода является динамический характер связи лиганда с поверхностью нанокристалла (связей S-S и/или Zn-S). Получаемые солюбилизированные наночастицы недостаточно стабильны, а в растворе всегда находится заметное количество несвязанного лиганда. Постепенный переход молекул лиганда в раствор приводит к осаждению нанокристаллов.

Методом повышения стабильности явилось использование двух-, трех- и более валентного (поливалентного) связывания лиганда с нанокристаллом [1]. Наиболее интересен метод, комбинирующий поливалентное связывание с последующим формированием полимерной оболочки вокруг CdSe/ZnS нанокристалла, предложенный Аливасатосом [4, 5]. На поверхности нанокристаллов формируют слой окиси кремния с силоксаном, далее силоксановые группы полимеризуют и ковалентно присоединяют к ним метокси-соединения (например, аминопропил триметоксисилан). Покрытые полимеризованным силоксаном нанокристаллы очень стабильны. Основной недостаток описанного метода заключается в сложности и продолжительности процедуры солюбилизации, больших потерях материала и малом выходе солюбилизированных нанокристаллов (единицы миллиграммов). Кроме того, квантовый выход флуоресценции нанокристаллов, солюбилизированных по этой методике, редко превышает 20%.

Кроме обеспечения водорастворимости и биосовместимости нанокристаллов, солюбилизирующие агенты выполняют также защитную функцию, предохраняя флуоресцентные метки от воздействия биологической среды в виде содержащихся в ней тушителей флуоресценции, ухудшающих оптические свойства нанокристаллов. К сожалению, синтезируемые новые лиганды часто специализированы под конкретную задачу, что ограничивает их общую применимость.

 

 

Пептидный синтез

Перспективным продолжением данной работы является «сшивание» белков с водорастворимыми квантовыми точками, т.е. пептидный синтез. Данное направление актуально для биологических применений квантовых точек (например, создания биомаркеров).

Образование пептидной связи в мягких условиях удается лишь при активировании карбоксильного компонента одной из аминокислот, вступающей в реакцию (рис.3). Вторая аминокислота Б (аминокомпонент) атакует активированный карбоксильный компонент аминогруппой с образованием пептидной связи. Незащищенная аминофункция карбоксильного компонента А тоже может реагировать, что приводит  к нежелательным побочным продуктам — линейным и циклическим пептидам. Для однозначного протекания реакции следует временно блокировать все функциональные группы, не участвующие в образовании пептидной связи, т.е. проводить процесс многоступенчато.

 

Рис. 3. Основной принцип пептидного синтеза [2].

 

В первую очередь получают частично замещенные аминокислоты, при этом они одновременно теряют цвиттерионную структуру. Вторая ступень, собственно образование пептидной связи, протекает в две стадии. Сначала нужно активировать N-защищенный карбоксильный компонент. Затем происходит собственно образование пептидной связи, которое протекает либо одноступенчато (вместе с активированием), либо последовательно в следующую стадию. На третьей ступени защитные группы селективно отщепляются, причем полученные частично защищенные производные дипептидов могут использоваться для дальнейших синтезов как карбоксильные или аминокомпоненты. Само собой разумеется, что в случае синтеза дипептида обе защитные группы удаляются одновременно.

Образование пептидной связи можно рассматривать как нуклеофильную реакцию полярной двойной связи. Образование пептидной связи должно протекать в мягких условиях, поэтому необходимо активировать карбоксильную группу (Rj — остаток карбоксильного компонента). Повышение электрофильных потенциалов достигается введением электроаффинных -I или -М (индуктивных или мезомерных) заместителей (XR'), которые снижают электронную плотность как на карбонильном углероде, так и на карбонильном кислороде. Благодаря этому повышается чувствительность к нуклеофильному воздействию аминокомпонента (R2 — остаток аминокомпонента).

 

Схема 1. Образование пептидной связи [2].

 

Нуклеофильный аминокомпонент воздействует на углеродный атом карбоксила свободной парой электронов; при этом происходит перераспределение электронов с образованием промежуточного продукта, который, обладая повышенной реакционной способностью, расщепляется с выделением R'X-.

Лишь немногие методы синтеза пептидов имеют практическое значение. Это азидный метод, метод смешанных ангидридов карбоновых и алкилугольных кислот, метод активированных эфиров и, наконец, карбодиимидный метод (рис.4), который в своей модифицированной форме (карбодиимид с добавками) наиболее широко используется в синтезах.

К протонированному карбодиимиду присоединяется анион карбоксильного компонента с образованием ацилуреида I (О-ациллактим, производное изомочевины), который с аминокомпонентом образует пептид с отщеплением замещенной мочевины (путь а). Протежированная форма ацилизомочевины Iа может реагировать со следующей молекулой ациламинокислоты с образованием симметричного ангидрида III и N,N'-дизамещенной мочевины (путь в). Симметричный ангидрид может реагировать с аминокомпонентом, образуя пептид и одну молекулу ациламинокислоты (путь г).

 

Рис. 4. Механизм образования пептидной связи с помощью ДЦГК. R — циклогексил, R, — остаток N-защищенной аминокислоты или пептида, R2 — остаток С-защищенной аминокислоты или пептида [2].

 

Катализируемая основаниями перегруппировка О-ациллактима I в производное ацилмочевины (путь б) является нежелательной реакцией, так как приводит к неактивному соединению II. Эта реакция (О — N-миграция ацильной группы) катализируется не только избытком третичных оснований, катализ вызывается также аминокомпонентом и самим карбодиимидом, которые обладают достаточной основностью для этого.

Применение дициклогексилкарбодиимида

N,N'-дициклогексилкарбодиимид (R — циклогексил) особенно пригоден в качестве конденсирующего реагента в тех случаях, когда продукт хорошо растворим в растворителях, обычно применяемых для пептидных синтезов.

Образующаяся при проведении синтезов дициклогексилкарбодиимидным методом N,N'-дициклогексилмочевина выпадает из реакционной смеси. Дициклогексилкарбодиимидные сочетания можно проводить в присутствии воды, так как скорости гидролитического и аминолитического расщепления О-ациллактима заметно различаются.

ДЦГК-метод особенно пригоден при ступенчатом синтезе пептидных фрагментов. Этим методом можно соединять без рацемизации пептидные фрагменты, имеющие на С-конце пролин или глицин. Во всех других случаях существует опасность рацемизации. Другим недостатком является уже упоминавшееся образование ацилмочевины. Этой побочной реакции можно в какой-то степени избежать, поддерживая низкую температуру и применяя неполярные растворители. Применение в качестве растворителей диметилформамида и N,N'-диметилацетамида приводит к образованию производных ацилмочевины. Эти растворители даже при высокой степени чистоты содержат небольшие количества диметиламина, способствующего О→N-миграции ацильной группы. Далее, ДЦГК-активирование незащищенных остатков аспарагина и глутамина приводит к соответствующим нитрилам вследствие дегидратации амидных групп. Поэтому целесообразно при конденсациях с карбодиимидом использовать производные аминокислот, полностью защищенные по боковым функциям.

 

Экспериментальная часть

Введение

Целью данной курсовой работы является изучение влияния длины УВ скелета кислоты на устойчивость коллоидных частиц в водной фазе.

Для применения КТ в биологии и медицине необходимо создать гидрофильную оболочку на поверхности наночастиц. Нами для изучения был выбран способ модификации поверхности с помощью меркаптокислот.

В данной работе использовался метод гидрофилизации коллоидных КТ с использованием меркаптокислот - один из наиболее простых и легкоосуществимых. Он основан на обмене гидрофобных лигандов, которые находятся на поверхности КТ, на гидрофильные меркаптокислоты. При этом сера соединяется с поверхностью КТ, а гидрофильная карбонильная группа, находящаяся на поверхности КТ, обеспечивает устойчивость коллоидной системы в воде.

В раствор коллоидных КТ в органическом растворителе добавляется меркаптокислота либо раствор кислоты, после чего эта смесь перемешивается в течение определённого промежутка времени. Из исходного раствора КТ осаждаются центрифугированием и полученный осадок растворяют либо в воде с добавлением щелочи, либо в буферном растворе.

Известно, что высокая поверхностная активность коллоидных ПАВ очень сильно зависит от длины углеводородного радикала. Увеличение длины радикала на одну группу CH2 приводит к возрастанию поверхностной активности приблизительно в 3,2 раза (правило Дюкло-Траубе) [8].

При большой длине углеводородных радикалов, когда заметно проявляется взаимодействие между молекулами ПАВ на поверхности, поверхностная активность увеличивается медленнее, чем это следует из правила Дюкло-Траубе. И все же с увеличением длины углеводородного радикала поверхностная активность ПАВ повышается.

В нашем случае оба конца молекулы полярны, а их разделяет УВ радикал. Поэтому устойчивость лигандов на поверхности обусловлена гидрофобным взаимодействием данных радикалов между собой и созданием, так называемой органической «шубы» между полярными слоями HS- и COOH. Данная «шуба» в том числе экранирует нанокристалл от тушителей флуоресценции, присутствующих в воде.

 

 

 

 

Методики

В курсовой работе была использована методика, по переводу квантовых точек в воду, приведенная в статье [3].

1 мл квантовых точек диспергировали в растворе 200мг меркаптокислоты в 4 мл 1,4-диоксана (99%). Смесь перемешивали в течение 18 часов, после этого центрифугировали в течение 5 минут при 2000 об/мин, декантировали и промывали диоксаном 3 раза. После каждого промывания осадок центрифугировали при тех же условиях. После последнего центрифугирования слили супернатант и осадок растворили в 4 мл деионизированной воды + 0,5 мл 0,1 М раствора NaOH. Квантовые точки частично диспергировали. Конечный раствор еще раз центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин.