Ферменты брожжения

Введение.

В настоящее время, спиртовая  промышленность, представляет собой  одну из крупных, научно-технически развитую отрасль. Очень хорошо освоенны процессы неприрывной технологии разваривания зерна и картофеля, сбражевания  сусла из мелассы, осахаривания разваренной  массы, а также её вакуумного охлаждения. Разваренную массу, на некоторых  заводах, осахаривают при помощи поверхностных или глубинных  культур плесневых грибов. На многих других заводах устанавливаются  солодовки с передвижной грядкой  и при этом используются побочные продукты. В основном производстве, уровень механизации превышает  показатель 90%, а ПРТС (погрузочно-разгрузочные, транспортные,складские работы) –  примерно 80%. Почти во всех странах  мира в больших или меньших  количествах существует производство спирта из различных видов сырья : сахарной свеклы, зерна, картофеля, сахарного  тросника, тросниковой или свекловичной мелассы. В те годы СССР стоял на первом месте по выпуску спирта. Так же производился синтетический,сульфитный и гидролизный спирты, которые  применялись в технических целях. В научно-техническом развитии спиртовой  промышленности, СССР так же занимал  первое ведущее место в мире. На зарубежных заводах при изготовлении спирта применялось периодически дейстующее оборудование (исключение – ректификация спирта и перегонка бражки).

В достижении высокого современного научно-технического уровня, технология спирта, в создании и совершенствовании, которой принимали участвие выдающиеся учёные и ведущие инженеры многих стран (особую лепту внесли отечественные  специалисты) прошла длиный и тернистый  путь.

Только в 1814 г. К. С. Кирхгоф открыл осахаривание солодом, т. е. ферментативный катализ, в основу легло открытие гидролиза крахмала. Позже А. И. Ходнев на примере гидролиза крахмала развил теорию образования промежуточных соединений между субстратом и катализатором. Чрезвычайное физическое состояние катализатора, ученье о котором было положенно в дальнейшем в современном представленнии о механизме катализа. В советское время, А.Л. Курсанов и А.И. Опарин внесли громадный вклад в развитие ученья о ферментах растительного происхождения и их роли в живой клетке.

Главными, основными задачами спиртовой промышленности были и остаются : завершение и внедрение непрерывных технологических процессов на всех заводах, которые работают на зерно-картофельном сырье; повышение механизации ПРТС-работ и уровня автоматизации технологических процессов, и всецелая автоматизация мелассно-спиртового производства; освоенние процессов осахариванния разваренной массы методом глубинной культурой плесневых грибов взамен солода; использование всех отходов мелассноспиртового производства при этом исключая промышленные стоки; внедрением биологическичистой очистки сточных вод, непосредственно на самих заводах; продолжение улучшения качества работы всех заводов и повышение эффективности и производительности работы в спиртовом производстве.

В безкислородном пространстве живут и размножаются микроорганизмы, в результате процесса брожения они  получают жизнедеятельную энергию. Под воздействием микроорганизмов  происходит распад органически веществ (в основном сахаров) всё это вместе с окислительно-восстановительной  реакцией представляет собой очень  распространнёный вид брожения. В  процессах брожения никогда не происходит окончательного процесса окисления  органических элементов. Многие процессы брпожения происходят анаэробно, то есть без участия кислорода. 

 Способ анаэробного извлечения энергии брожения считается наиболее древний по сравнению с дыханием,так  как присутствующий на нашей планете  кислород получается в процессц фотосинтеза, который возник на Земле гораздо  позже. 

 Сегодня даже тяжело вспомнить когда  люди начали пользоваться продуктами полученными в процессе брожения. Много веков человечество пользовалось этими процессами при изготовлении вина,чуть ранее при приготовлении  молочнокислой продукции, изготовлении сыров. Но никто и не подозревал, что всё это происходит с помощью  микроорганизмов. В ХVII в. голландец, по происхождению, алхимик Ван Хельмонт ввёл понятие процесс брожения, для  процесса выделения газов (fermentatio –  кипение). Чуть позже Луи Пастер (основоположник современной микробиологии) в XIX в. доказал, что разное брожение вызванно разными  микроорганизмами и что процесс  брожения – это итог их жизнедеятельности.  

 
  Из глубокой древности известны  способы сбражевания сахаров.  В течении многих веков виноделы  и пивовары пользовались способностью  некоторых видов дрожжей влекших  за собой спиртовое брожение, по итогу чего сахар преобразовывался  в спирт. 
  
  Процесс брожения в основном происходит при помощи дрожжей, но также используются некоторые виды бактерий, а также некоторые грибы. В разных странах пользуются различными видами микроорганизмов: в Европе, например, для получения спирта используют в основном дрожжами (Saccharomyces), в Азии – мукоровыми грибами, в Южной Америке – бактериями (Pseudomonas Lindneri).

Спиртовое брожение — химическая реакция брожения, осуществляемая дрожжами, в результате которой одна молекула глюкозы преобразуется в 2 молекулы этанола и в 2 молекулы углекислого газа.

Реакция спиртового брожения подобна гликолизу. Расхождение начинается только после образования пирувата.Конечный этап гликолиза заменяется двумя ферментативными реакциями. Сначала пируват подвергается декарбоксилированию, продуктом которого являетсяацетальдегид. Данная реакция происходит при участии пируватдекарбоксилазы, ТПФ и ионов магния.

После ацетальдегид восстанавливается водородом, который отщепляется от кофермента НАДН. При этом ацетальдегид восстанавливается до этанола. Собственно, цель спиртового брожения — это окисления NADH, чтобы он мог снова принять участие в гликолизе. Катализатором является алкогольдегидрогеназа.

Таким образом, продуктами спиртового брожения являются этанол и  , а не молочная кислота, как в молочнокислом брожении.

В результате получается реакция:

Ферменты дрожжей

Дрожжи богаты ферментами, содержащимися  в клеточных стенках, цитоплазме, вакуоле и ядре клетки. Они способствуют усвоению питательных веществ, их превращению  и, соответственно, росту и размножению  клеток. В дрожжах различают 6 групп  ферментов — гидролазы, трансферазы, оксидоредуктазы, лиазы, изомеразы  и лигазы, в частности синтетазы  или синтазы. 
          В 1961 г. Международной комиссией были введены правила по номенклатуре и классификации ферментов. Так, например, в наименовании фермента сначала следует обозначение субстрата, затем молекулы-акцептора, а потом — типа реакции. Так как в этом случае наименования получаются очень длинными и неудобными, в рамках данной книги мы будем использовать тривиальные названия ферментов. 
           Гидролазы вызывают гидролитическое расщепление веществ, причем соединения гликозида, сложного эфира и пептида расщепляются в результате присоединения радикалов воды. Гидролазы состоят чаще всего из одного протеина, причем область реакции зависит от функциональных групп различных аминокислот. В клетке дрожжей представлены карбогидразы (например, мальтаза, сахараза, инвертаза и мелибиаза (α-галактозидаза)), а также эстеразы, включающие некоторое количество фосфатаз и небольшое число липаз. Содержание пептидаз в живой клетке очень незначительно — наряду с эндопептидазой присутствуют несколько экзопептидаз и амилаз. 
Перечисленные ниже ферменты состоят из протеинов и так называемых простетических групп или коферментов. 
           Трансферазы переносят группы атомов (фосфорил-, амино-, гликозилгруппы и т.д.) от одной молекулы (донора) к другой молекуле (акцептору). Трансфосфорилазы способствуют переносу остатков фосфата и осуществляют тем самым важную функцию в промежуточном обмене веществ. Кроме того, дрожжи содержат гексокиназу, фосфоглицерат- и пируваткиназу. Все эти ферменты участвуют в спиртовом брожении. Также присутствуют ферменты, катализирующие перенос остатков фосфата на рибозу, аденозан, холин и т.д. Трансгликозидазы участвуют в синтезе гликогена, а трансаминазы переносят аминогруппы. 
          Оксидоредуктазы переносят водород или электроны от одного субстрата к другому. Следует различать дегидрогеназы, которые могут действовать как аэробные (атом водорода, отщепленный от субстрата, переносится на кислород) или анаэробные ферменты (атом водорода переносится на другую молекулу, не на кислород). Оксидазы переносят атомы водорода на молекулярный кислород, а оксигеназы катализируют встраивание молекулы кислорода в субстрат. К первой группе относятся пероксидазы и каталазы. 
           Лиазы разрывают одну химическую связь (например, С-C-) без присоединения воды. Их подразделяют на декарбоксилазы (кетокислотные и аминокислотные декарбоксилазы) и дегидратазы (энолазу, фумаразу). К первой группе относится пируват-декарбоксилаза, обычно обозначаемая как «карбоксилаза». Она вызывает отщепление карбоксильной группы (декарбоксилирование) пировиноградной кислоты до ацетальдегида с образованием CO2. 
            Изомеразы катализируют внутримолекулярную перегруппировку атомов в молекуле с возможной внутримолекулярной окислительно-восстановительной реакцией (например, превращение глюкозы во фруктозу). В случае внутримолекулярной перегруппировки фосфорильная группа переносится с первого на шестой атом углерода молекулы глюкозы. Таким образом, следует различать фосфогексозоизомеразы и фосфомутазы. 
           Лигазы (называемые также синтетазами и синтазами) позволяют осуществлять соединение двух молекул, причем для такого соединения необходима энергия. К ним относятся все ферменты, способные синтезировать связи C-N-, C-S-, C-O- и С-С-.

Ферментативный гидролиз крахмала

Ферментативный гидролиз крахмала - процесс сложный. Он происходит под действием амилолитических  ферментов, которые могут действовать  на клейстеризованный и неклейстеризованный  крахмал. Последний осахаривается  очень медленно. Температура клейстеризации ячменного крахмала 60-80°С, Образовавшийся крахмальный клейстер под действием  амилаз вначале превращается в растворимый  крахмал, а затем в мальтозу и  декстрины (амилодекстрины, эритродекстрины, ахроодекстрины, мальтодекстрины). Под  действием амилазы амило- и эритродекстрины  расщепляются и в заторе остаются ахроо- и мальтодекстрины. Присутствие  в сусле этих декстринов придает  пиву вкус и вязкость. Дрожжами декстрины  не сбраживаются. Мальтоза легко и  быстро сбраживается дрожжами. В результате осахаривания крахмала в заторе образуется сбраживаемый углевод-мальтоза и несбраживаемые углеводы - декстрины. Соотношение сбраживаемых и несбраживаемых углеводов (отношение  сахара к несахару) является одним  из показателей качества сусла. Это  соотношение должно быть определенным для каждого сорта пива. Отношение  сахара к несахару в сусле колеблется в таких пределах: для жигулевского пива 1:0,33-1:0,43; для рижского и московского  пива 1:0,22-1:0,33; для темных сортов пива 1:0,43-1:0,54. Скорость ферментативного гидролиза крахмала и соотношение продуктов гидролиза зависит от температуры, кислотности и концентрации затора. 
Оптимальная температурная зона для β-амилазы солода 45-51°C, а для α-амилазы 51-60°С. Если осахаривание вести при оптимальной температуре, то в заторе образуется большое количество мальтозы, с повышением температуры количество образующегося сахара уменьшается, а количество несахара увеличивается. 
            Оптимальная pH для солодовой амилазы лежит около 4,7-5,1. Некоторые вещества, содержащиеся в заторе (пептоны, соли кальция, клейстеризованный крахмал), оказывают защитное влияние на амилазу, поэтому оптимальная зона ее действия может сдвигаться. Например, оптимальная зона pH для α- и β-амилазы сдвигается с 4,7-5,1 до 5,5-5,8. 
            С повышением концентрации затора увеличивается его вязкость, затрудняются процессы диффузии между ферментами и молекулами крахмала, затрудняется и замедляется гидролиз крахмала. Поэтому при затирании соблюдают необходимое соотношение солода и воды. 
Процесс осахаривания контролируется йодной пробой. Если капля затора после смешивания с каплей йода не дает синего или красно-бурого окрашивания, осахаривание считается законченным.

           Расщепление крахмала. Амилазы (различают α- и β-амилазы) расщепляют нативный крахмал в мальтозу, β-Амилаза воздействует на молекулу амилозы или амилопектина с нередуцирующего конца и отщепляет молекулу мальтозы, α-Амилаза, напротив, действует на внутренние связи, причем при этом образуются низкомолекулярные декстрины, содержащие в местах присоединения глюкозных остатков по α-1,6-связи боковые цепочки. Образовавшиеся декстрины становятся доступными для нового воздействия β-амилазы, но после того, как β-амилаза гидролизует клейстеризованный при затирании крахмал до мальтозы, оставшиеся негидролизованные декстрины могут быть вновь атакованы α-амилазой. Оба фермента способны расщеплять только α-1,4-связи, так что даже при длительном воздействии в оптимальных условиях может образоваться только около 80 % мальтозы, мальтотриозы и глюкозы. Остаток представлен предельными декстринами с α-1,6-связями. Дальнейшее расщепление декстринов происходит с помощью предельной декстриназы или R-фермента, способствующих разрыву α-1,6-связей, что в амилопектине или олигосахаридах приводит к гидролизу мест разветвления. 
Мальтоза подвергается дальнейшему расщеплению мальтазой с образованием глюкозы. Сахароза расщепляется сахаразой до глюкозы и фруктозы. 
β-Амилаза содержится в непроросшем ячмене в свободной и связанной формах и может быть активирована обработкой размолотого зерна протеолитическими ферментами или восстановителями с тиоловыми группами. Латентный фермент связан с нерастворимым протеином дисульфидными мостиками, и во время проращивания он переходит в растворимое состояние и активируется. Лучше всего β-амилаза активируется при средней влажности проращивания, достигая максимума активности уже на 5-е сут проращивания при повышенном содержании CO2 в окружающем воздухе. Повышение температуры проращивания снижает содержание β-амилазы. 
В зерне, находящемся в состоянии покоя, α-амилаза не определяется, так как она присутствует в латентной форме и активируется во время проращивания. Катализаторами процесса ее образования являются гиббереллины, поступающие в алейроновый слой. α-Амилаза синтезируется аминокислотами. 
Расщепление крахмала при солодоращении ограничено. Важнейшей задачей проращивания ячменя является активация и образование амилолитических ферментов (α- и β-амилазы), так как без них при последующем затирании полное осахаривание невозможно. Свое основное действие оба вида амилаз оказывают лишь во время затирания при расщеплении крахмала до сахаров и декстринов.