Флуометрический анализ

Содержание

Введение…………………………………………………………………………..3

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа………………....6

1. Понятие и сущность флуориметрии…………………………………………6
2. Физическая сторона флуориметрического анализа………………………..9
3. Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ…………….11
4. Обратные задачи флуориметрии насыщения……………………………...16
5. Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе………………………………………………….19

Глава II Применение флуориметрического анализа к некоторым лекарственным веществам………………………………………………………20

2. Определение содержания рибофлавина (витамина В2) методом флуориметрии………………………………………………………………..20

2.2 Флуориметрическое определение содержания родамина………………...22

2.3 Флуориметрическое определение кверцетина в лекарственных формах

       рутина………………………………………………………………………..24

2.4 Флуориметрическое определение 2-амино-4-окси-6- птеридинкарбоновой

      кислоты в лекарственных формах фолиевой кислоты……………………25

Заключение………………………………………………………………………26

Список используемой литературы……………………………………………..27

 

 

 

Введение

Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств продолжают оставаться актуальными направлениями развития фармацевтического анализа. Это обусловлено, в том числе, общим увеличением числа лекарственных средств, введением в качестве лекарственных, новых биологически активных веществ, принадлежащих к различным классам природных и синтетических соединений.

Проблема  ухудшения качества продукции отечественного фармацевтического рынка неоднократно обсуждался на заседаниях правительства  РФ и связывается специалистами  с тремя основными факторами:

1. Нелегальный ввоз лекарственных препаратов и биологически активных добавок из-за рубежа.
2. Несовершенство законодательной базы регулирующей оборот лекарственных средств на территории страны.
3. Высокие технические возможности нелегального производства препаратов - фальсификатов и ограниченные аналитические возможности выявления подделки лекарственных средств. [1]

Поэтому совершенствование способов контроля качества при производстве и особенно количественное определение при  клиническом использовании может  считаться одной из наиболее важных задач современной клинической  фармации.

Разработка  методик контроля качества лекарственных  средств базируется на использовании  новейших аналитических методов, таких  как ВЭЖХ и ГЖХ, ИК и ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия. Не теряют своей  значимости ТСХ, спектрофотометрия. Однако условием испытания подлинности остается идентификация ионов и функциональных групп органических веществ, входящих в структуру молекул, посредством их химического анализа. Химия развивается столь быстро, что даже при наличии экспрессных инструментальных, химические методы не только сохраняют свое значение, но и продолжают развиваться. [4]

Преимущества, которые дает флуориметрия в анализе  лекарственных средств в различных  объектах, способствовали введению этого  метода в перечень фармакопейных.

В функциональном анализе фармацевтических соединений предполагается обычно, что  молекулу органического соединения можно рассматривать как сумму  практически независимых функциональных групп и, следовательно, принимается, что физические и химические свойства соединения определяются свойствами этих функциональных групп. При проведении идентификации сложных молекул, несомненно, следует учитывать взаимное влияние функциональных групп, которое  может вызвать неожиданное изменение  свойств этих групп, а также отклонения наблюдаемых свойств от теоретически ожидаемых.

Методы  флуоресцентного анализа имеют  важное самостоятельное значение особенно в промышленности при получении  фармацевтических препаратов, так как  проведение функционального анализа - важная и часто необходимая стадия при определении качественного  состава сложных смесей. [13]

Учитывая  вышесказанное, нами показан поиск  теоретически обоснованного подхода  к разработке реакций флуоресцентного  определения. В основу подхода была положена идея получения конкретного  производного, флуоресцирующего в видимой  области спектра. Результатом исследования стали флуоресцентные реакции и  разработанные на их основе методики обнаружения и количественного  определения примесей в лекарственных  препаратах.

Чистота - одно из основных требований, предъявляемых  к лекарственным препаратам, обуславливающим  как возможность получения чистого  соединения, так и его стабильность. Это требование непрерывно растет по отношению к лекарственным препаратам. Содержание основного вещества в  настоящее время пока составляет не более 97-98%, поэтому как методы очистки, так и методы контроля очень важны при оценке качества лекарственных  средств. [36]

 

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа

1. Понятие и сущность флуориметрии

Флуориметрия (ее называют также люминесцентным анализом) – это определение концентраций вещества в соответствии с интенсивностью флуоресценции, которая возникает в процессе облучения изучаемого вещества с помощью ультрафиолетовых лучей. [8, 9]

 При наличии соответствующих  условий таким методом можно  детектировать присутствие даже  ничтожных количеств. Процедуры  флуорометрии делят на макроанализ, когда исследования производятся невооруженным глазом, и на микроанализ, когда определения осуществляют посредством микроскопа и других приборов. В качестве метода диагностики и спектрального анализа в отношении сложной органики люминесцентный анализ имеет достоинства, способствующие его чрезвычайной привлекательности. [5] 

 В первую очередь потому, что многие из органических  соединений имеют способность  флуоресцировать в случаях оптического  возбуждения при квантовом выходе, который можно полагать достаточным для достоверного и уверенного решения задач диагностики. Именно поэтому флуориметрия считается одним из наиболее чувствительных методов в оптической спектроскопии. [6]

Флуориметрия - один из эмиссионных аналитических  методов и относится к фотометрическим  методам. Позволяет обнаруживать микро- и нанограммовые количества анализируемых  веществ с достаточной точностью, что используется в анализе примесей. Наличие двух характерных максимумов (в спектре возбуждения и в  спектре излучения флуоресценции) увеличивает избирательность определения. Изменение цвета и выхода флуоресценции  при смене растворителя и рН используется для идентификации и исследования структурных особенностей молекул.

     Во  флуоресцентном  анализе растворов  обычно используются следующие свойства:

     а) способность к флуоресценции  самого соединения в зависимости  от свойств растворителя ( рН, диэлектрическая  проницаемость);

     б) возникновение или  изменение флуоресцентных свойств  в присутствии катионов металлов (хелатообразование);

     в) образование флуоресцирующих  ассоциатов;

     г) возникновение или  изменении флуоресценции флуорогенного  метчика при присоединении к  нему определяемого соединения;

     д) возникновение флуоресценции  в процессе взаимодействия исследуемого соединения и реагента в результате образования нового соединения с высоко поглощающей устойчивой структурой;

     е) возникновение флуоресценции  в результате присоединения к  исследуемому соединению "флуорофора" - группировки, повышающей поглощающую и излучающую способность;

     ж) возникновение флуоресценции  в результате электронных перегруппировок  внутри молекулы без изменения  ее формулы (окислительно-восстановительные  процессы);

     з) «тушение» собственной  флуоресценции одного вещества в присутствии друг. [7, 30]

Тем не менее, флуоресцентный метод  имеет ряд недостатков, основными  из которых можно считать низкий порог концентрационного тушения  и необходимость использования  стандартных образцов при проведении анализа флуоресцирующих соединений. Эти недостатки существенно ограничивают использование флуориметрии в фармацевтической и биофармацевтической практике, не позволяя проводить флуоресцентные определения в растворах веществ, имеющих концентрацию более 15-20 мкг/мл. Необходимость разбавления анализируемых проб приводит к увеличению систематических ошибок анализа и заметно снижает экспрессность методик. [2]

Одна из главных проблем связана с растворителем пробы. Нередко случается, что некоторая методика вполне пригодна для определения данного соединения, однако проба оказывается нерастворимой в рекомендуемом растворителе. В настоящее время известно, что титрование можно проводить во многих органических растворителях. Если рекомендуемый в методе растворитель не растворяет пробу, то всегда удается подобрать другой растворитель, в котором можно провести титрование. При выборе растворителя следует учитывать реакционную способность проб. Например, ангидриды кислот или хлорангидриды реагируют со многими растворителями, однако, можно подобрать растворители, которые с ними не реагируют и в которых можно провести титрование. К таким растворителям относятся диметилформамид, ацетон и хлорбензол. Кроме того, некоторые растворители могут оказывать влияние на аналитическую реакцию. Поэтому необходимо подобрать такие растворители, в которых растворяются и проба, и реактив и возможно протекание химического процесса.

Применение неводных высококипящих растворителей позволяет ускорять особенно медленные аналитические реакции. [18, 35]

 

 

2. Физическая сторона флуориметрического анализа

Поглощение  света, безусловно, является необходимым  условием флуоресценции, но в тех  случаях, когда поглощение раствора слишком высоко, световой поток не проходит через него и не может  служить источником возбуждения. Как  известно, при высоких концентрациях  участки раствора, расположенные  ближе к источнику возбуждения, поглощают большее количество света, чем дальше расположенные. Интенсивность  освещения раствора и, соответственно, излучение прогрессивно убывают  по мере удаления от источника (внутреннее экранирование).

Процесс флуоресценции веществ подчиняется  законам светопоглощения, как и  все оптические методы анализа: интенсивность  проходящего через раствор вещества светового потока уменьшается согласно закону Бера - Ламберта: I = I0 -kcl,

где: I - интенсивность светового потока, проходящего через раствор;

Iо- интенсивность падающего света;

К - коэффициент поглощения раствора;

С - концентрация вещества;

l - длина пути светового потока в поглощающем растворе вещества.

Интенсивность флуоресценции (испускаемой во всех направлениях) зависит от количества поглощаемого флуоресцирующим объектом света и квантового выхода флуоресценции :

F = I0 (1 – 10-D),

где: F - общая интенсивность флуоресценции;

D - оптическая плотность раствора.

При малых величинах D« 0,1 формула имеет следующий вид:

F = 10 ф(1 - (1 - D + D2/2' - D3/3' In), или F = I0*D. Таким образом, зависимость F от D (с учетом значения квантового выхода и интенсивности возбуждающего света) является линейной, что более удобно для экспериментальных исследований. Переход к линейной зависимости позволяет рассчитывать концентрацию флуорофоров по законам светопоглощения.

Однако  необходимо вычислить минимальное  значения оптической плотности раствора D0, при которых ошибка измерения интенсивности флуоресценции не превышает некоторой заданной величины.

Как правило, линейная зависимость флуоресценции  от концентрации раствора наблюдается  до тех пор, пока количество флуоресцирующего вещества не становится настолько большим, что раствор начинает поглощать  значительное количество возбуждающего  света. Боуен и Уокс показали, что  для получения линейной зависимости  раствор должен поглощать менее 5% возбуждающего света. Поэтому Dn = 2,0x0,05 = 0,1, то есть предел линейной зависимости флуоресценции от концентрации определяется достижением оптической плотности D = 0,1.

Поскольку D = KCL, то одной и той же оптической плотности могут соответствовать различные концентрации в зависимости от толщины поглощающего слоя. Следовательно, использование кювет с различной толщиной рабочего слоя позволяет применять флуориметрию для измерения высоких концентраций без предварительного разбавления проб. При практическом использовании этого приема выявлена закономерность, связывающая изменения толщины рабочего слоя кюветы и предела обнаружения методики: при уменьшении рабочего слоя в 2 раза верхний пределе линейности калибровочного графика увеличивается в среднем в 1,4 раза.

Измерения отношения интенсивности флуоресценции  вещества к интенсивности облучающего  пробу светового потока (F/I0) позволяет определять величину, подобную оптической плотности в спектрофотометрии. Эта величина зависит только от концентрации исследуемых веществ при использовании стандартных кювет, что позволяет стандартизовать измерения флуоресценции и избавится от необходимости использования стандартных растворов.