Хроматография в современной химии

Хроматография в современной химии

Одна  из важных задач современной химии  – надежный и точный анализ органических веществ, часто близких по строению и свойствам. Без этого невозможно проведение химических, биохимических  и медицинских исследований, на этом в значительной степени базируются экологические методы анализа окружающей среды, криминалистическая экспертиза, а также химическая, нефтяная, газовая, пищевая, медицинская отрасли промышленности и многие другие отрасли народного  хозяйства.

Один из наиболее чувствительных методов – хроматографический анализ, впервые предложенный российским ученым М.С.Цветом в начале XX в. и к концу века превратившийся в мощнейший инструмент, без которого уже не могут обходиться как синтетики, так и химики, работающие в других областях.

Разделение Цвет проводил в колонке, показанной на рис. 1. Смесь веществ А, Б и В – природных пигментов, первоначально находящихся в зоне е, – разделяется при приливании соответствующего растворителя Д (элюент) на отдельные зоны.

Рис. 1.  Хроматографическое разделение пигментов хлорофилла М.C.Цветом:   а – адсорбент;   б – колонка;  в – приемник;   г – делительная воронка;   д – вата. Смесь веществ А, Б и В, сначала находящихся в зоне е, разделяется при элюировании растворителем Д (элюент) на отдельные зоны, движущиеся с разными скоростями к выходу из колонки

 
Как всегда, все началось, казалось бы, c самого простого, что мог проделать любой школьник. В прежние годы школьники, в том числе и автор этой статьи, писали чернилами. И если промокашка попадала на чернильное пятно, то можно было заметить, что раствор чернил разделялся на ней на несколько «фронтов». Хроматография основана на распределении одного из нескольких веществ между двумя, как говорят, фазами (например, между твердым телом и газом, между двумя жидкостями и др.), причем одна из фаз постоянно перемещается, т. е. является подвижной.

Это значит, что  такая фаза, например газ или жидкость, все время продвигается, нарушая  равновесие. При этом чем лучше  то или иное вещество сорбируется (поглощается) или растворяется в неподвижной  фазе, тем скорость его движения меньше, и, наоборот, чем меньше сорбируется  соединение, т. е. обладает меньшим сродством  к неподвижной фазе, тем скорость перемещения больше. В итоге, как  показано на рис. 2, если вначале мы имеем  смесь соединений, то постепенно все  они, подталкиваемые подвижной фазой, движутся к «финишу» с различными скоростями и в конце концов разделяются.

Рис. 2. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А₁ разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А₂ – к неподвижной фазе. А '₁ и А '₂ – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой

Практически образец  смеси веществ вводят, например, шприцем в слой неподвижной фазы, а затем различные соединения, входящие в состав смеси, вместе с подвижной фазой (элюент) двигаются вдоль слоя, подгоняемые этой фазой. Скорость перемещения зависит от величины взаимодействия (сродство) компонентов в неподвижной и подвижной фазах, и в результате достигается разделение компонентов.

После разделения необходимо идентифицировать все компоненты и оценить их количественно. Такова общая схема хроматографии.

Следует отметить, что этот современный метод позволяет  в течение нескольких минут определить содержание десятков и сотен различных  соединений в смеси, причем даже в  ничтожных, «следовых» количествах ~10–8%.

Рассмотрим подробнее  хроматографический способ анализа. Хроматографические системы можно разделить по следующим принципам:

– агрегатное состояние  подвижной и неподвижной фаз; 
– геометрические характеристики системы; 
– механизм взаимодействия между разделяемым веществом и фазами.

В качестве подвижной  фазы используется газ или жидкость. В качестве неподвижной, или стационарной, фазы применяются твердые вещества или жидкости.

По расположению фаз хроматографические системы подразделяют на две группы: плоскостные и колоночные.

Последние, в свою очередь, разделяются на:

– насадочные, заполненные  зернистым твердым материалом (мелкие шарики), либо являющимся разделительной средой, либо служащим носителем неподвижной  жидкой фазы; 
– капиллярные, внутренние стенки которых покрыты пленкой неподвижной жидкости или слоем твердого адсорбента (поглотитель).

Взаимодействие  между разделяемым веществом  и фазами хроматографической системы может осуществляться или на поверхности фазы, или в объеме. В первом случае хроматография называется адсорбционной, во втором –распределительной.

Механизмы разделения молекул в хроматографических системах чаще всего сводятся к следующим:

– неподвижная  фаза физически поглощает (сорбирует) разделяемые вещества; 
– неподвижная фаза химически взаимодействует с разделяемыми веществами; 
– неподвижная фаза растворяет разделяемые вещества из раствора в несмешивающемся растворителе; 
– неподвижная фаза имеет пористую структуру, затрудняющую диффузию молекул разделяемых веществ в этой фазе.

Хроматография, начавшись  с самодельных устройств типа полоски бумаги, опущенной в растворитель, в настоящее время представлена сложнейшими инструментальными  системами, основанными на современных  точнейших, или прецизионных, принципах  и оснащенными компьютерным обеспечением. Достаточно сказать, что одна из лучших компьютерных фирм «Хъюлетт-Паккард» одновременно выпускает и современные хроматографы.

Схема процесса хроматографирования, в сущности, очень проста и показана на рис. 3. Далее примерно в такой последовательности будет рассмотрен принцип работы хроматографа.

Основные виды хроматографии

К основным видам  хроматографии относят адсорбционную, ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную, гель-фильтрационную и афинную хроматографию.

Адсорбционная хроматография. В этом случае разделение веществ осуществляется за счет выборочной (селективной) адсорбции веществ на неподвижной фазе. Такая селективная адсорбция обусловлена сродством того или иного соединения к твердому адсорбенту (неподвижной фазе), а оно, в свою очередь, определяется полярными взаимодействиями их молекул. Поэтому часто хроматографию такого типа используют при анализе соединений, свойства которых определяются числом и типом полярных групп. К адсорбционной хроматографии причисляют ионообменную, жидкостную, бумажную, тонкослойную и газо-адсорбционную хроматографию. Газоадсорбционная хроматография более детально описана в разделе «Элюентный анализ».

Рис. 4. Изображение структуры частицы  ионообменной смолы: · – заряженные функциональные группы, ковалентно связанные с нитями решетки;  ° – свободно перемещающиеся противоположно заряженные протовоионы, электростатически связанные с частицей смолы, способные претерпевать обмен с другими ионами

Ионообменная  хроматография. В качестве неподвижной фазы используют ионообменные смолы (рис. 4) как в колонках, так и в виде тонкого слоя на пластинке или бумаге. Разделение обычно проводят в водных средах, поэтому этот метод используется главным образом в неорганической химии, хотя применяются и смешанные растворители. Движущей силой разделения в этом случае является различное сродство разделяемых ионов раствора к ионообменным центрам противоположной полярности в неподвижной фазе.

Жидкостная  хроматография. В этом случае неподвижной фазой служит жидкость. Наиболее распространенным случаем является адсорбционный вариант жидкостной колоночной хроматографии. Пример разделения природных пигментов представлен на рис. 5.

Рис. 5. Хроматографическое разделение природных пигментов (флавонов и изофлавонов)

Бумажная  хроматография. В качестве неподвижной фазы используют полосы или листы бумаги (рис. 6). Разделение происходит по адсорбционному механизму, причем иногда его проводят в двух перпендикулярных направлениях.

Рис. 6. Схема разделения методом бумажной хроматографии:   А, Б и В – положения компонентов смеси по окончании хроматографического разделения.   Подвижная фаза впитывается в бумагу (неподвижная фаза) под действием капиллярных сил и переносит индивидуальные компоненты смеси с различными скоростями, зависящими от отношений растворимости этих компонентов в обеих фазах.   Отношение а/б = Rf (фактор запаздывания) характеризует данное разделяемое вещество

Тонкослойная  хроматография – это любая система, в которой неподвижной фазой является тонкий слой, в частности слой оксида алюминия (толщина 2 мм) в виде пасты, нанесенной на стеклянную пластинку. Пример такой системы и результаты разделения показаны на рис. 7.

Рис. 7. Камера для  тонкослойной хроматографии:а – общий вид; б – схематический разрез;   1 – подложка со слоем сорбента;   2 – край камеры;   3 – емкость для растворителя

Гель-фильтрационная, или молекулярно-ситовая, хроматография. Принцип разделения в таких системах несколько иной, чем в предыдущих случаях. Неподвижной фазой являются материалы, обычно гели, со строго контролируемой пористостью, в результате чего одни компоненты смеси в соответствии с размером и формой молекул могут проникать между частицами геля, а другие не могут. Наиболее часто этот вид хроматографии используется для разделения высокомолекулярных соединений. Один из вариантов применения этого метода – определение молекулярных масс разделяемых веществ, часто необходимых для химических исследований (рис. 8).

Рис. 8. Схема разделения методом гель-хроматографии: а –  начало разделения,   б – разделение,  в – конец разделения;   большие кружки – частицы геля,  большие точки – молекулы соединений с большой молекулярной массой,   маленькие точки – молекулы соединений с меньшей молекулярной массой

Афинная хроматография. Этот вид хроматографии основан на взаимодействии между веществом, с одной стороны, способным реагировать с выделяемым соединением, а с другой – связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество обладает сродством к выделяемому соединению и называется афинным лигандом.

Наиболее  часто этот метод находит применение в биохимическом анализе. Например, при пропускании через целлюлозу, активированную бромцианом, биологических  объектов-антигенов, содержащих белки, происходит их специфическое удерживание, как показано на схеме 1.

 

По  другому способу для присоединения  белков к гидроксильной группе целлюлозы  последнюю сначала обрабатывают 2-амино-4,6-дихлор-сим-триазином, а затем  продукт их взаимодействия вступает в реакцию с аминогруппой белка  по схеме 2:

Конечно, число способов хроматографирования не ограничивается перечисленными выше. Часто хроматографию сочетают с другими физико-химическими методами, например с масс-спектрометрией, но в данной статье стоит задача познакомить читателя лишь с общими принципами хроматографии. Поэтому далее рассмотрим обработку результатов хроматографирования.

Методы  проявления хроматограмм

Проявлением называется процесс переноса разделяемых  веществ подвижной фазой. Проявление можно осуществить тремя основными  способами: фронтальным анализом, вытеснением  и элюированием. Наиболее широко используется элюирование.

Фронтальный анализ. Это случай наиболее простой, т. к. здесь проба и служит подвижной  фазой. Ее непрерывно добавляют в  систему, поэтому нужны большие  объемы пробы. Результаты показаны на рис. 9.

Образование нескольких зон обусловлено различным  сродством разных компонентов к  неподвижной фазе. Передний край называют фронтом, отсюда и название. В первой зоне находится только наименее удерживаемое вещество А, которое движется быстрее всего. Вторая зона содержит вещество А и Б. Третья зона – смесь веществ А, Б и В. Во фронтальном анализе только компонент А получают в жидком виде.

Вытеснительный анализ. В этом случае подвижная фаза обладает большим сродством к неподвижной фазе, чем разделяемое вещество. В неподвижную фазу вводят небольшую пробу. Но из-за большого сродства подвижная фаза вытесняет и проталкивает все компоненты. Она вытесняет наиболее сильно сорбирующийся компонент В, который, в свою очередь, вытесняет вещество Б, а тот вытесняет наименее сорбирующийся компонент А. В отличие от фронтального анализа с помощью этого способа можно получить все основные компоненты в индивидуальном (жидком) виде.

Элюентный анализ. Подвижную фазу для перемещения растворенного вещества пропускают через хроматографическую систему. Разделение происходит за счет различного сродства компонентов смеси к неподвижной фазе и, следовательно, за счет разных скоростей их перемещения. Пробу малого объема вводят в хроматографическую систему. В итоге зоны с компонентами будут постепенно образовывать отдельные участки, разделенные чистым элюентом. Благодаря высокой эффективности разделения метод получил наиболее широкое распространение и в значительной степени вытеснил другие варианты разделения. Поэтому далее рассмотрим теорию и аппаратное оформление этого метода.