Использование бесхвостых амфибий в биоиндикации природной среды

   Таким  образом, цитологические исследования  печени выходящих на сушу сеголеток  являются хорошим показателем  состояния популяции, подверженной, влиянию антропогенных загрязнений.  Увеличение ядер в первую очередь  свидетельствует о загрязнении  водоемов, и для скорости проверки  состояния популяции можно использовать  только этот показатель.

5. К началу метаморфического климакса в гепатоцитах увеличивается содержание  гликогена, полисахаридов, липидов (Quetant 1973 и др.). Также была высказана мысль о том, что пока личинка не сделают минимального запаса энергии, их метаморфоз невозможен (Crump? 1981). Исследуя клетки печени, нетрудно проследить за содержанием в них липидов и использовать этот показатель в качестве индикатора загрязнения среды. Исследованиями В.А Бугаевой (1983) обнаружено начало жировых включений в гепатоцитах головастиков остромордой лягушки в «чистых» водоемах на 25-26 стадиях развития, в водоемах, подверженных антропогенному загрязнению, позднее- на26-27 стадиях. В период метаморфического климакса, когда животные не питаются, а затраты энергии в связи с перестройкой личиночных органов и тканей увеличиваются, идет интенсивное расходование жировых запасов. В клетках животных из «чистых» водоемов липиды сохраняются после окончания метаморфоза. Таким образом, развитие животных под воздействием неблагоприятных факторов сопровождается замедление процесса накопления и интенсивным расходом липидов в период метаморфического климакса. Это снижает жизнеспособность молодых особей, рекрутируемых в популяцию.
6. Наряду с перечисленными параметрами при выборе критериев оценки загрязненности среды и влияния на биоту может быть использован уровень обмена веществ. Показано, что интенсивность обмена животных, развитие которых проходило в антропогеном ландшафте, выше, чем сеголеток из «чистых» районов. Это в свою очередь ведет к увеличению энергозатрат и отражается на выживаемости животных.  

             

1.3 Методики отбора проб.

 

   Для оценки состояния популяции амфибий в районе действия промышленных предприятий, прежде всего, необходимо подобрать водоемы, которые являются местами икрометания. Они должны находиться на различном расстоянии от источника эмиссий. Это позволит проводить анализ в сравнительном плане. Необходимо давать полное описание водоемов (форма, площадь водного зеркала, глубина, освещенность, температура воды, характер грунта, происхождение, месторасположение относительно источника загрязнения, видовой состав растений и животных, гидрохимический анализ воды и грунта).

   Лягушки обычно откладывают  икру в неглубокие, хорошо прогреваемые  солнцем водоемы или заводи, где  нет сильного течения. Кладка  икры около суток может лежать  на дне; затем всплывает. За  развитием икры легко проследить  и в природе, в условиях лаборатории.  В зависимости от возраста  и вида самка откладывает, от 500 до 2750 яиц. В оптимальных условиях  выклев личинок происходит на 4-5 сутки. В этот момент кладку  следует взять из водоема, поместить  в кристаллизатор и подсчитать  соотношение вылупившихся личинок,  недоразвившихся и погибших яиц.  Обычно из одного водоема исследуется  не менее 5 кладок. Затем исследуемые  кладки возвращаются в водоем.

   Начальная плотность (число  личинок на 1 л воды) определяется с помощью следующих параметров: примерного объема воды в водоеме, количество кладок и среднего числа яиц в кладке с учетом их выживаемости. В конце периода, перед метаморфозом плотность личинок определяется с помощью биоценометра. Подсчитывается количество личинок, попавших в объем воды биоценометра в момент измерения. Плотность можно определить и с помощью мечения головастиков нейтральным красным (Северцов, Сурова, 1979).

   Количественный учет завершивших  метаморфоз и выходящих на  сушу животных сопряжен с большими  трудностями. Для их учета   используются все подручные средства, укладывая по периметру водоема  доски, палки, ветки, под которыми  обычно прячутся первые 10-12 часов  после выхода на сушу животные. Под этими укрытиями их достаточно  легко учесть. Подсчет следует  проводить не менее трех раз  в сутки и таким образом  можно установить процент вышедших  на сушу животных по отношению  к отложенной икре, процентное соотношение морфотипов, морфологические аномалии, динамику сроков развития всей популяции личинок.

   Для получения данных  по динамике роста и развития  личинок еженедельно из разных  участков водоема сачком берется  проба не менее 30 особей, длина  тела каждого животного измеряется  штангенциркулем с точностью  до 1 мм, взвешивание производится на торсионных весах с точностью до 1 мг. Предварительно каждое животное обсушивается фильтровальной бумагой. Величину относительного прироста массы тела личинок за каждые 7 дней определяли по формуле:

       

Где v₁ и v₂ – средний вес выборки животных в начале и в конце периода соответственно (Шмальгаузен, 1935). Стадия развития определяется по классификации П. В.Терентьева (1950). После взятия промеров животные возвращаются в водоем. После резорбции хвоста и выхода, животных на сушу из каждого водоема берется, проба 30 особей для морфофизиологических исследований. Сеголетки взвешиваются, измеряются, умерщвляются декапитацией, вскрываются, определяется вес печени, готовятся ее препараты. Работа выполняется в соответствии с «Правилами проведения научных исследований с использованием экспериментальных животных», утвержденными распоряжением Президиума АН СССР от 2 апреля 1980 г. № 12200-496.

   Печень сеголеток – самый  крупный, хорошо препарируемый  орган, в норме темно- красного  цвета. Взвешивание производится  на торсионных весах, индекс  печени определяется как отношение  веса печени к весу тела, выражается  в промилях.

   Исследование цитологических  показателей производится по  следующей методике. На чистое  обезжиренное предметное стекло  наносятся отпечатки печени (мазки  или растирание между стекол  приводят к сильному повреждению  и деформации клеток) и 5 минут  фиксируют метанолом. Препараты  окрашиваются по методу Романовского (Ромейс, 1953). По этой методике  препараты изготавливаются быстро  и сохраняют свои исходные  качества несколько лет.

   С помощью рисовального  аппарата РА-4 при увеличении светового  микроскопа 10х20 с каждого препарата  зарисовывается 100 клеток. Измерение  цитоплазмы и ядра производится  по двум перпендикулярным диаметрам,  вычисляется площадь проекции  клеток по формуле S круга. Определение сроков исчезновения липосом производится следующим образом. Из каждого водоема отлавливали 50 особей 30 стадий развития, через сутки животных, достигших 31 стадии развития, помещали в отдельный кристаллизатор. Животных не кормили, содержали при температуре 20⁰ С, ежедневно вскрывали, готовили препараты печени и определяли наличие липосом.

   Газообмен у сеголеток  определяли по качеству выделенного  CO₂  с помощью оптико-акустического газоанализатора 0А- 550I (Добринскяй, Малафеев, 1974).Учитывая существенные различия размеров сеголеток, при вычислении дыхательного обмена исходили из известного правила Рубнера (количество выделенного CO₂ относили к величине, определяемой как час, где P – вес животного). После намерения уровня метаболизма животных выпускают в район их изъятия.

   Итак, для контроля за  изменениями, происходящими в  природной среде в результате  хозяйственной деятельности человека  в комплексе видов – индикаторов,  наряду с другими группами  животных целесообразно использовать  амфибий. При этом следует учитывать  влияние среды, как на ранние  этапы онтогенеза, так на взрослых  животных. Получение объективной  оценки в каждой конкретной  ситуации возможно только при  использовании совокупности показателей.

 

1.4  Цели и задачи исследования.

Цель исследования – выявить наиболее информативные морфо-  физиологические, цитогенетические, популяционные параметры вида

Rana ridibunda Pall. и обосновать эффективность  их использования для биоиндикации  экологического состояния водотоков.

    Для достижения поставленной  цели решались следующие задачи:

1. Исследование водотоков на  содержание тяжелых металлов  в воде.

2. Характеристика структуры популяций  R. ridibunda Pall.

3. Отбор информативных для биоиндикации  морфофизиологических параметров

R. ridibunda Pall.

4. Выявление основных фенодевиантов

5. Оценка стабильности развития  популяций R. ridibunda Pall.

 

1.5  Практическая значимость результатов

 

    Выявлены морфофизиологические  и генетические особенностей амфибий, которые позволяют оперативно провести биоиндикацию экологического состояния водотоков. Выявленный комплекс характеристических параметров может быть использован при проведении экологического мониторинга и в системах экологического прогнозирования. Полученные результаты могут рассматриваться как базовые при экологической оценке водотоков Ульяновской области.

 

1.6 Основные положения.

 

1. R. ridibunda Pall. является высокоинформативным биоиндикатором экологического состояния водотоков.

2. В неблагоприятных экологических  условиях, регистрируется широкий  спектраномалий развития R. ridibunda Pall., снижается численность популяций, смещается половое соотношение, нарастает доля морфы striata.

3. Организм R. ridibunda Pall. реагирует на  загрязнение водотоков комплексом  морфофизиологических реакций, проявляющихся  в уменьшении размеров тела, увеличении  индексов сердца и почек, снижении  индексов печени, селезенки, и общей упитанности, обусловленных нарушением морфофизиологического и цитогенетического гомеостаза.

 

Глава 2. Материал и методы исследования.

 

2.1 Характеристика районов исследования

     Исследования проводились  в Ульяновской области в 2004-2007 гг. Объектом изучения являлась озерная лягушка (R. ridibunda Pall.).

    В качестве загрязненного  водотока была выбрана р. Свияга, а экологически

чистого водотока – р. Уса.

    В Кузоватовском районе  Ульяновской области берет начало р. Свияга. На территории Ульяновской области имеет протяженность 216,4 км, является правым притоком Волги. Русло реки извилистое, ширина 20-30 м, средняя глубина на перекатах 0,6 м, на плесах 1,3 м. Река сильно загрязнена. В Тереньгульском районе Ульяновской области берет начало р. Уса. В своем течении она сходна с р. Свияга, является экологически чистым водотоком. Долина реки пойменная, шириной до 3-4 км.

    Для выявления адаптаций,  возникающих под действием загрязнения водотоков у представителей вида R. ridibunda Pall., нами было проведены исследования на трех уровнях: на уровне популяции (оценивалась численность, половой и фенетический состав), на уровне особи (оценивалась морфология, физиология и стабильность развития) и на уровне клетки (оценивалась стабильность ядерных структур) (рис. 1).

    Степень загрязнения  воды тяжелыми металлами определяли  в отделе химико-аналитического  контроля растениеводческой, пищевой  продукции и кормов ФГУ «Станция Агрохимической Службы г. Ульяновска». В 2004-2006 гг. были проведены анализы воды из мест обитания озерной лягушки на содержание тяжелых металлов. В исследуемых образцах определяли общее содержание таких элементов, как медь, свинец, кадмий, цинк, хром, никель. Анализы проводились атомно-абсорбционным методом.

 

 

Рис. 2. Направления  исследований

 

    Определение видового  и количественного состава амфибий проводилось прижизненно по стандартной методике (Кузьмин, 1999; Земноводные…, 2001) на каждых 100 м береговой линии. Половую и фенетическую структуру популяций озерной лягушки анализировали весной без умерщвления животных и изъятия их из мест обитания (Kabisch, 1990). Полиморфизм полученных выборок изучался по соотношению в популяциях морф striata – полосатая особь, со светлой дорсомедиальной полосой на спине и maculata - пятнистая особь (Жукова, Кубанцев, 1976; Щупак, 1977).

    Измерения стандартных  морфологических параметров проводилось с помощью штангенциркуля с точностью до 0,1 мм (Определитель земноводных.., 1977).

    Измерялись 9 показателей по Н.В. Ковылиной (1999). Оценивались средние значения морфологических параметров, коэффициенты вариации. При сравнении средних величин параметров использовался критерий Стьюдента (Sokal, Rohlf, 1981).

    Для выявления физиологического  состояния амфибий рассчитывали  индексыорганов (Шварц и др., 1968). С помощью электронных весов  определялась масса тела, затем производилось вскрытие и изъятие внутренних органов (сердца, печени, почек, селезёнки), взвешивание 1_их на электронных весах (с точностью до 0,001 г). Индекс упитанности, рассчитывали по Г.В. Никольскому (1974). Все расчеты проводили отдельно для самцов и самок.

    Типовая принадлежность  аномалий определялась по общепринятым классификациям (Borkin et al., 1986; Вершинин, 1989; Lada, 1999). Показатель разнообразия типов аномалий (μ) и долю редких типов аномалий (h) рассчитывали по Л.А. Животовскому (1982).

    Оценку стабильности  развития проводили по показателю  флуктуирующей

асимметрии (Чубинишвили, 1998; 2001). Всего  было использовано 13 стандартных признаков. В качестве показателя асимметрии для межпопуляционного сравнения использовалась средняя частота асимметричного проявления на признак (ЧАПП) (Leary et al., 1983; 1984; Чубинишвили, 1998; 2001). Статистическая значимость различий между выборками оценивали по t-критерию Стьюдента (Sokal, Rohlf, 1981). Степень загрязнения водной среды от нормы определяли по нарушению стабильности развития, основанной на флуктуирующей асимметрии, и оценивали по пятибалльной шкале (Чубинишвили, 1998).