Контрольная работа по дисциплине "Биоиндикация и биотестирование"

Установлено, что на разных фазах роста культура инфузорий обладает разной чувствительностью к воздействию токсических веществ, и эти различия могут быть весьма существенными. Поэтому для получения однозначного и объективного ответа культуру инфузорий берут на одной фазе роста (стационарная фаза).

 

 

БИОТЕСТИРОВАНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ФОТОБАКТЕРИЙ

(Приказ  Минздрава России от 8.06.2000 г. МР  № 11-1/134-09)

Принцип метода заключается в установлении различия между уровнем люминесценции бактерий Photobacterium phosphoreum, помещенных в анализируемую пробу (опыт) и уровнем люминесценции бактерий, помещенных в 3% раствор хлорида натрия (контроль). Критерием токсичности является снижение уровня люминесценции бактерий на 50% и более в опыте по срав-нению с контролем в течение 30 минут. Люминесценцию бактерий измеряют при помощи специального прибора – биолюминомера и выражают в условных единицах.

При сравнительном исследовании установлено, что этот метод является менее чувствительным по сравнению с использованием инфузорий. Причина различия, вероятнее всего, заключается в большей устойчивости прокариотов (бактерий) как более простой биологической системы по сравнению с эукариотами (инфузориями) к воздействию неблагоприятных факторов.

Использование специальной измерительной аппаратуры для оценки результатов биотестирования является большим преимуществом этих двух методов, так возможности субъективной оценки результатов исследования минимальны.

Дорогостоящая аппаратура и относительно высокая стоимость лиофилизированной культуры фотобактерий препятствует использованию этих методов для демонстрации биотестирования в школьных условиях.

Вполне же доступным и легко наблюдаемым для оценки токсичности проб является реакция гибели инфузорий под действием токсического вещества. Эту реакцию в токсикологии начали применять еще в 40-х годах 20 века. Ее проявление без труда регистрируют путем визуального микроскопического наблюдения. Для этого на предметное стекло помещают 1 мл пробы в которую добавляют 0,1 мл культуры. Учет проводят с помощью микроскопа или лупы. Чем быстрее клетки гибнут, тем токсичнее проба. Если клетки гибнут в течение 3 минут, то проба резко токсична, за 10 минут – токсична и за 3 часа – слабо токсична. В случае выживания инфузорий в течение суток проба признается нетоксичной.

При этом, в большинстве случаев, можно различить три фазы ответной реакции:

- фаза возбуждения, которая характеризуется резким увеличением скорости движения клеток;

- фаза угнетения, когда скорость  движения клеток снижается;

- фаза лизиса клеток инфузорий, которую определяют по остановке их движения, а в некоторых случаях по признакам их распада.

Длительность фаз ответной реакции зависит от вида инфузорий природы токсина и его концентрации.

Фаза возбуждения длится обычно не более нескольких минут. В начале фазы угнетения скорость движения клеток резко замедляется и, достигнув определенного уровня, остается почти неизменной. Дальнейшее ее снижение происходит медленно. При низкой концентрации токсического вещества фаза лизиса может и не наступить, но при этом в морфологии клетки происходят хорошо заметные изменения, характер которых зависит от природы действующего на клетку вещества.

Так, например, катионы 2-валентной меди и соединения ртути вызывают у инфузорий паралич сократительной вакуоли. Клетка теряет возможность выводить воду и поддерживать осмотический баланс с окружающей средой. В результате она увеличивается в объеме (разбухает), принимает почти шарообразную форму, после чего клетка разрывается и цитоплазма вытекает наружу.

В качестве иллюстрации токсического воздействия можно использовать медь сернокислую 5-водную по ГОСТ 4165 в концентрациях от 0,2 до 0,7 мг на 1 литр дистиллированной воды (модельный токсикант). 

Для содержания и культивации культуры парамеций используется среда Лозина-Лозинского: вода дистиллированная                1 литр

                                             натрия хлорид                                1 г

                                            калия хлорид                                 0,1 г

                                            магния сульфат                             0,1 г

                                           кальция хлорид 2-водный            0,1 г

                                          натрий углекислый кисл.              0,2 г

Раствор хранится в холодильнике до 7 суток. Для работы используется среда разбавленная в 10 раз. Разбавленная среда не хранится.

Выращивают  культуру в любой удобной посуде – колбы, стаканы, используя в качестве корма дрожжи хлебопекарские по ГОСТ 171.

В широкогорлую коническую колбу на 200 мл вносят суспензию инфузорий в среде Лозина-Лозинского в количестве 100 мл. Добавляют дрожжи в количестве  1мг на 1мл среды. Выращивание ведут при температуре  20 -25 градусов.

При перерывах в проведении исследований культуру поддерживают как посевной материал. В чашку Петри помещают 2-3 зерна риса, добавляют среду ЛЛ около 30-40мл  и помещают клетки инфузорий  50-100кл/мл.

1 раз в 2 недели меняют среду  и зерна риса.

Концентрацию клеток подсчитывают следующим способом:

взболтать исходную взвесь, отобрать пипеткой 0,5 мл добавить 4,5 мл 1% раствора хлорида натрия для снижения подвижности инфузорий. Через 2-5 минут отбирают 1мл разбавленной взвеси и распределяют этот объем на сухом стекле в виде 10 капель. С помощью микроскопа или лупы подсчитывают количество клеток во всех каплях. Результат пересчитывают на 1 мл исходной взвеси.

Для ведения культуры тетрахимены используют углеводно-солевую дрожжевую среду: глюкоза 15г, дрожжевой экстракт 1г , морская соль 1г, дистилированная вода 1л, рН 7,0-7,5. Среду разлить в пробирки и стерилизовать на водяной бане 30 мин.         

Исходную культуру можно приобрести в различных научных организациях, выделить из водоемов, приобрести у аквариумистов.

Для самостоятельного выделения культуры в чистую стеклянную банку отбирают пробу в прибрежной зоне экологически чистого водоема среди водной растительности. Полученные организмы не должны быть адаптированы к каким- либо токсинам. Пробу отбирают с небольшой глубины в несколько сантиметров, в банку помещают немного донного осадка или кусочек водного растения. В полученной пробе не всегда находится большое количество инфузорий. Если же добавить в нее несколько зерен риса, то вскоре в ней размножатся бактерии а вслед за ними и инфузории. Проба не должна находится в сильно освещенном месте, так как в ней разовьются водоросли и фототрофные жгутиконосцы; температура должна быть комнатной. При исследовании проб под микроскопом инфузории обнаруживаются сразу благодаря своим размерам и подвижности. Чтобы получить чистую культуру инфузории, нужно изолировать отдельную клетку и поместить ее в питательную среду, свободную от других простейших. Делается это при помощи тонко оттянутой пипетки (пастерки) под микроскопом или бинокулярной лупой при небольшом увеличении. Из капли пробы, помещенной на предметное стекло отбирают 1 инфузорию интересующего вида и помещают в каплю чистой (не дистиллированной) воды. Затем ее снова отбирают чистой пипеткой и помещают в следующую каплю. Так повторяют несколько раз, в зависимости от густоты культуры, пока в капле не будет заметно посторонних организмов. Размножившись, клетка образует клональную культуру.

При этом можно использовать как парамеции, так и инфузории Tetrahymena pyriformis.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемой литературы

 

1. Мотузова Г.В., Безуглова О.С. Безуглова Экологический мониторинг почв: учебник для вузов. – М. «Гаудеамус» 2007 - 232с.
2. Туровцев В.Д., Краснов В.С. Биоиндикация: учебное пособие. – Тверь: Твер. гос. ун-т 2005 – 260с.
3. Бубнов А.Г., Баймова С.А., Гущин А.А., Извекова Т.В. Биотестовый анализ – интегральный метод качества объектов окружающей среды: учебно-методическое пособие – Иваново: Иван. гос. хим.-технол. ун-т. 2007 – 112с.
4. Чеснокова С.М., Биологические методы оценки качества объектов окружающей среды: учеб. пособие. – Владимир: Владим. гос. ун-т. 2007 – 84с.
5. Ляшенко О.А., Биоиндикация и биотестирование в охране окружающей среды: учебное пособие. – СПб: СПб ГТУРП 2012 – 67с.
6. Опекунова М.Г., Биоиндикация загрязнений: Учеб. пособие. – Спб: С.-Петерб.  
   ун-т. 2004 – 266с.
7. Мелехова О.П., Егорова Е.И., Евсеева Т.И., Биологический контроль окружающей среды: биоиндикация и биотестирование: учеб. пособие для студ. М. «Академия» 2007 – 288с.