Анализ опухолеспецифических форм белка В23/нуклеофозмина

    Тиреоглобулин – белок, продуцируемый железами щитовидной железы  и повышающийся при многих  ее  заболеваниях. Используется в качестве  онкомаркера  для ведения пациентов, перенесших хирургическое удаление щитовидной железы по поводу  рака. Повышение тиреоглобулина свыше 10нг/мл является признаком рецидива опухоли.

    Раково-эмбриональный  антиген (РЭА) - представляет собой гликопротеин с высоким содержанием углеводов, вырабатываемый в тканях пищеварительного тракта эмбриона и плода. РЭА определяется в сыворотке крови плода, но не в крови беременных женщин. После рождения его синтез подавляется, и антиген практически не выявляется ни в крови, ни в других биологических жидкостях взрослых здоровых людей. При развитии опухолей различной локализации уровень РЭА повышается и достаточно точно отражает состояние злокачественного процесса. Повышение концентрации РЭА наблюдается не только при различных карциномах пищеварительного тракта, но и при РЛ, РМЖ, раке головы и шеи, злокачественных образованиях соединительнотканного происхождения. РЭА рекомендуется определять совместно с различными органоспецифическими опухолевыми маркерами. РЭА является белком острой фазы, поэтому его уровень может подниматься у больных с разнообразными аутоиммунными, острыми и хроническими воспалительными заболеваниями, при циррозе, хронических гепатитах, ХП, язвенной болезни, пневмонии, бронхитах, туберкулезе, эмфиземе легких, муковисцидозе и др. Однако скорость роста и максимально достигаемый уровень маркера значительно ниже, чем при злокачественных заболеваниях. Незначительное повышение РЭА наблюдается у курящих людей.

    Нейрон-специфическая енолаза (NSE) – гликолитический нейрон-специфический изофермент енолазы. Енолаза катализирует взаимное превращение 2-фосфоглицерата и фосфоенолпирувата в гликолитическом пути и участвует в образовании высокоэнергетической фосфатной связи. Существует несколько димерных изоферментов, среди которых димеры αγ и γγ известны как NSE. Название связано с тем, что впервые экспрессия NSE была выявлена в нейронах, нейроэндокринных клетках или злокачественных опухолях, происходящих из этих клеток. Фермент присутствует в клетках нейроэктодермального происхождения, нейронах головного мозга и периферической нервной ткани. Исследование NSE применяется для диагностики и мониторинга эффективности терапии, а также, как прогностический фактор при МКРЛ и нейробластомы. Повышенное содержание маркера в сыворотке наблюдается также при развитии опухолей нейроэктодермального или нейроэндокринного происхождения, лейкозах, после лучевой или рентгенотерапии, рентгеновского обследования. Незначительное повышение концентрации NSE может наблюдаться при доброкачественных заболеваниях легких.

При заборе крови необходимо помнить, что фермент  содержится в эритроцитах и тромбоцитах, следовательно, гемолиз значительно  завышает результаты анализа, а центрифугирование необходимо проводить не позднее, чем через час после взятия пробы. По различным данным, исследование NSE можно также проводить и в спинномозговой жидкости. При заболеваниях или повреждениях ЦНС наблюдается значительное увеличение содержания фермента в ликворе. Уровень NSE может повышаться и при таких неврологических процессах, как эпилепсия и субарахноидальное кровоизлияние.

    Антиген плоскоклеточной  карциномы (SCCA, SCC) – это опухолеассоциированный антиген плоскоклеточных карцином различных локализаций: шейки матки, головы и шеи, пищевода, легких, вульвы. Впервые был выделен из тканей плоскоклеточной карциномы шейки матки в 1977 г. Группа SCCA принадлежит к семейству серпинов - ингибиторов сериновых протеиназ, и состоит более чем из 10 белков, различающихся по изоэлектрическим точкам, от 5,9 до 6,6. Обычно их разделяют на 2 группы – кислые SCCA, с pI < 6,25, и нейтральные SCCA, с pI от 6,25 и выше. Слюнные железы продуцируют SCCA. Некоторые особенности аминокислотной последовательности в структуре активного центра, подобные имеющимся у α2-антиплазмина (ингибитора плазмина и химотрипсина), позволяют предполагать у SCCA множественные физиологические функции: участие в регуляции дифференцировки нормального плоскоклеточного эпителия, стимуляция роста опухолевых клеток путем ингибирования процесса апоптоза. При проведении анализа на определение SCCA следует помнить, что загрязнение проб слюной или элементами кожи может вести к ложноположительным результатам. Повышенный уровень SCCA обнаруживается при доброкачественных заболеваниях кожи и при беременности сроком более 16 нед. Уровень SCCA может быть повышен у больных с бронхиальной астмой, при почечной или печеночной недостаточности.

    Гастрин рилизинг пептид, проформа (ProGRP) – гормон кишечника, пептид, состоящий из 27 аминокислот, структурно и функционально подобный С-концевому участку бомбезина. Первично был выделен из желудка свиньи. GRP присутствует в тканях мозга, в нервных волокнах, в нейроэндокринных клетках, клетках ЖКТ и легких. Хорошо известно, что он секретируется клетками МКРЛ по аутокринному пути. Было показано, что GRP обладает митогенной активностью по отношению к МКРЛ. Несмотря на это, использование GRP в качестве маркера для рутинных исследований затруднено из-за его нестабильности в крови и сложности его выделения. В настоящее время разработаны тест-системы для определения ProGRP (области 31-98, общей для трех типов GRP человека) – более стабильного белка-предшественника гормона, также являющегося специфичным маркером для МКРЛ. Определение сывороточного уровня ProGRP значимо и может быть использовано в диагностике, лечении, прогнозе и раннем выявлении рецидивов у пациентов МКРЛ. Редко наблюдается повышение ProGRP у пациентов с доброкачественными заболеваниями легких (хронический бронхит, фиброз легких) и при почечной дисфункции (до 300 нг/л).

    Остеопонтин (OPN) – белок костной ткани, является секреторным сиалопротеином, имеет в своем составе RGD-последовательность, отвечающую за взаимодействие с рецепторами интегринов, участвует в связывании остеокластов на поверхности кости. Это кислый кальций-связывающий гликофосфопротеин, который обнаруживается во всех биологических жидкостях и в межклеточном матриксе. Его м.м. от 44 до 66 кДа, в зависимости от типа клеток. Первоначально OPN был описан как белок, ассоциированный с клеточной трансформацией. Он играет важную роль в процессах онкогенеза и метастазирования. Гиперэкспрессия OPN выявлена при РЛ, РМЖ, РП, РЖ, РЯ, РПЖ и раке пищевода. OPN является секреторным белком, его концентрация может быть определена методом ИФА в плазме.

    Инсулиноподобные  факторы роста (IGF). IGF-I и -II – сывороточные факторы, относящиеся к семейству инсулина, и известные соответственно как соматомедин С и А. Оценка уровней IGF-I и -II является полезным диагностическим тестом при исследовании гормон роста-зависимых болезней. IGF играют важную роль при неопластических процессах. Они образуются в стромальных клетках простаты и паракринно воздействуют на эпителиальные клетки, что приводит в конечном итоге к усилению их пролиферации. Определение концентрации IGF-I может использоваться в прогнозе риска для нескольких форм рака. Определение IGF-I может быть полезно в комбинации с другими ОМ.

    Цитокератины (Cyfra 21-1, TPA, TPS, UBC). Цитокератины – белки промежуточных филаментов цитоскелета эпителиальных клеток, обладают тканевой специфичностью, и характер их экспрессии меняется при злокачественной трансформации клеток. Цитокератины поступают в циркуляцию в виде отдельных частично деградированных белковых фрагментов, формируя растворимые белковые комплексы различных размеров. Цитокератины – маркеры пролиферации опухоли с хорошо определенными характеристиками у пациентов с эпителиально-клеточными карциномами. Определение содержания цитокератинов в сыворотке или моче пациента позволяет проводить диагностику и мониторинг течения заболевания, дает возможность предсказать развитие метастазов раньше, чем это возможно с помощью обычных методов, и является надежным дополнительным показателем эффективного лечения болезни и основанием для раннего принятия решения.

    MESOMARK (SMRP) - это дифференцировочный антиген, в норме присутствующий на мезотелиальных клетках. Ген мезотелина кодирует белок-предшественник, дальнейший процессинг которого приводит к образованию мезотелина, соединенного с мембраной гликозилфосфатидилинозитоловой связью, и отщеплению N-концевого фрагмента массой 31 кДа – мегакариоцит-потенцирующего фактора. Растворимые пептиды семейства мезотелина (SMRP), образующиеся в дальнейшем при протеолитическом расщеплении, попадают в кровоток. Биологические функции мезотелина неясны. Повышение концентрации SMRP показано при мезотелиоме, аденокарциноме поджелудочной железы и РЯ. Верхний предел нормы 9 нг/мл. Как было показано в недавних исследованиях, тест-система MESOMARKR может быть использована для скрининга группы риска – людей, имевших в прошлом контакт с асбестом и ранней диагностики мезотелиомы, а также для дифференциальной диагностики мезотелиомы и других злокачественных или доброкачественных новообразований в легких. У людей, находившихся в контакте с асбестом, у которых был обнаружен повышенный уровень SMRP, в течение 1-5 лет развивалась мезотелиома или РЛ. Мезотелин является перспективным кандидатом для опухолеспецифической терапии благодаря своей ограниченной экспрессии в нормальных тканях и высокой продукции некоторыми опухолями. На его основе уже разработана противоопухолевая вакцина, которая проходит клиническую оценку у пациентов с мезотелин-экспрессирующими опухолями поджелудочной железы и яичника. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Токсическое и экотоксическое действие применяемых веществ 

    Химические  вещества представляют собой источник наибольшей опасности при работе в нашей лаборатории. Практически  все использованные в ходе выполнения дипломной работы растворители, а также реактивы для электрофореза и иммуноблоттинга являются легковоспламеняющимися и горючими жидкостями, обладающими токсическими, а в некоторых случаях мутагенными и канцерогенными свойствами (акриламид, 3,3’-диаминобензидин). Поэтому важно не допускать их случайных разливов и испарения. Степень поражения зависит от концентрации, температуры и времени воздействия.

    В соответствии с правилами техники  безопасности все растворители и  их сливы хранились в толстостенной посуде с притёртыми пробками в металлических шкафах вдали от радиаторных батарей. При работе с вредными и пожароопасными веществами использовалось герметичное оборудование. Герметичность обеспечивалась вакуумной смазкой, прокладками.

Для мелкодисперсных  веществ, которые способны к образованию  взрывоопасных смесей (акриламид), важно  не допускать образования пыли.

В качестве первичных средств пожаротушения  в лаборатории имеются песок и асбестовые одеяла. Индивидуальными средствами защиты служат хлопковые халаты, резиновые перчатки, очки, защитные маски и защитные экраны. В лаборатории имеется аптечка для оказания первой медицинской помощи. Работа с пожароопасными и токсическими веществами проводилась в вытяжном шкафу.

         Для характеристики вредных веществ применяется система предельно допустимых концентраций этих соединений в окружающей среде при воздействии их на организм на протяжении разных отрезков времени. Величины ПДК и характеристики токсикологических свойств веществ, использованных в работе, приведены в таблице.

    Токсичность – это способность веществ  вызывать в организме нарушения  нормальных процессов жизнедеятельности  при воздействии их на организм в  условиях работы даже с малыми количествами этих веществ.

Для токсичных  веществ установлены предельно  допустимые концентрации в воздухе  рабочей зоны. ПДК_р.з. – это концентрация вещества, которая при ежедневной работе (не более 41 часа в неделю) в течение всего рабочего стажа не может вызвать заболевания или отклонения в состоянии здоровья, обнаруживаемые современными методами медицинского обследования в процессе работы или в отдаленные сроки жизни настоящего или последующих поколений.

    В соответствии с ПДК_р.з. вещества подразделяют на 4 класса опасности:

чрезвычайно опасные вещества — ПДК_р.з. < 0.1 мг/м³;

высокоопасные вещества — 0.1 мг/м³ < ПДК_р.з. < 1 мг/м³;

умеренно  опасные вещества — 1 мг/м³ < ПДК_р.з. < 10 мг/м³;

малоопасные вещества — ПДК_р.з. > 10 мг/м³;

    Вещества, оказывающие токсическое действие и их свойства, а также способы оказания первой помощи при отравлении ими приведены в таблице.

Таблица. Токсические свойства веществ.