ДНҚ теориялық негіздері және ДНҚ вакцинасы

Мазмұны

Анықтамалар,белгілеулер мен қысқартулар                                          3

1 Кіріспе                                                                                                          4

2 Негізгі бөлім                                                                                                5           

       1.1 ДНҚ теориялық негіздері және ДНҚ вакцинасы

1.1.1ДНҚ теориялық негіздері                                                                       5

1.1.2 ДНҚ бөліп алу                                                                                         9

       1.2 ДНҚ-вакциналарын алу технологиясы                                               10

1.2.1 ДНҚ –вакциналарының ерекшеліктері                                                 11

1.2.2 Иммунизацияның тиімділігі мен қауіпсіздігін жоғарылату               13

1.2.3 Жаңа вакциналарды алу мен өндіруді оңайлату                                  14

3 Қорытынды                                                                                                16         

        Қолданылған әдебиеттер тізімі                                                                  17                 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

    Анықтамалар,белгілеулер мен қысқартулар

Анықтамалар

Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ)- нуклеин қышқылдарының бірі. ДНҚ тірі тірлішік генетикасындағы белгілерді сақтаумен, оларды ұрпақтан-ұрпаққа тасымалдаумен және олардың қызметін реттеуменайналысатын қышқыл.

Вакциналар-белсенді иммунитетті жаратуға арналған препараттар – вакциналар.

Клондау ( грек. clon - ұрпақ, бұтақ) - организмдерді жыныссыз жолмен көбейту арқылы сол организмдерге ұқсас ұрпақтар алу.

Берілген жұмыста мынадай белгілеулер қолданылады:

0С, мМ, %, мм2, мл, М , мкл

Қысқартулар

ДНҚ- Дезоксирибонуклеин қышқылы 

 РНҚ-Рибонуклеин қышқылдары

АҚШ-Америка Құрама Штаттары

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                           Кіріспе

 

Курстық жұмыстың өзектілігі. Вакцинация реципиентте патогенді микроағзаларға қарсы иммунитеттің қалыптасуына мүмкіндік береді және осымен бірге оны инфекциялардан қорғайды. Вакциналарды пероралды немесе парентералды егуге жауап ретінде адамның ағзасында патогенді микроағзаларға қарсы антиденелер қалыптасады, олар ары қарай келесіде вирусті жұқтыру барысында оның инактивациясына әкеледі (жойылуына немесе өлуіне), оның пролиферацисын шектейді және аурудың дамуына кедергі келтіреді.

Вакцинация эффектісін 200 жыл бұрын —1796 ж. —Эдвард Дженнер ашты.

Қазіргі вакциналар өлген (инактивирленген) немесе тірі патогенді микроағзалардан алынады, бірақ вирулентті штаммдардан емес. Дифтерия, коклюш, оспа және полиомиелит сияқты ауруларға қарсы вакциналардың алудағы айтарлықтай жетістіктерге қарамастан, заманауи вакциналардың өндірісі көптеген шектеулермен қақтығысады.

Бүгін қолданылып жатқан вакциналарды оларды алу әдістемелеріне байланысты келесі типтерге бөлуге болады:

• тірі аттенуирленген вакциналар;

• инактивирленген вакциналар;

• микроағзалардың тазартылған компоненттерінен құрылған (протеиндер немесе полисахаридттер) вакциналар;

• гендік инженерия әдісі арқылы алынған микроағзалардың компоненттерінен құрылған рекомбинантты вакциналар.

Курстық жұмыстың мақсаты: ДНҚ вакциналарын алу технологиясын ашып, қарастыру болып табылады.

Курстық жумыстың міндеттер:

- ДНҚ теориялық негіздерін қарастыру;

- ДНҚ алу технологиясын қарастыру;

- ДНҚ вакциналарының әлеуетті басымдықтарын қарастыру және т.б

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Негізгі бөлім

1.1 ДНҚ теориялық негіздері және ДНҚ вакцинасы

1.1.1 ДНҚ теориялық негіздері

Дезоксирибонуклеин қышқылы (ДНҚ) — нуклеин қышқылдарының бірі. ДНҚ тірі тірлішік генетикасындағы белгілерді сақтаумен, оларды ұрпақтан-ұрпаққа тасымалдаумен және олардың қызметін реттеумен айналысатын қышқыл. ДНҚ-ның басты қызметі — Рибонуклеин қышқылдары (РНҚ) мен ақуыздың құрылымы жайлы ақпараттарды ұзақ уақыт бойы сақтау.

Ядролы жасушасы бар (эукариоттар) ағзалардың ядросында орналасқан хромосомаларында, кейде митохондриялары мен пластидтерінде ДНҚ болады.  Ал прокариоттарда (жасушасында ядросы болмайды)

Ақуыз молекуласы сияқты, ДНҚ молекуласы да биологиялық полимер. ДНҚ-ның молекулалық салмағы 10 млн. болады, кейбір жағдайда (ақуыздың биосинтезіне байланысты) 50-100 млн-ѓы дейін жетеді. ДНҚ полимерлері мен мономерлерінің ролін комплементтік негізіне сәйкес бірінене кейін бірі орналасатын нуклеотидтер атқарады.

Нуклеин қышқылдары ең алғаш жасушаның ядросынан табылды, ол латынша «нуклеус» – ядро деген мағынаны білдіреді. Сондықтан нуклеин қышқылдары деп аталған.

Нуклеин қышқылдарының 2 түрі бар: дезоксирибонуклеин «ДНҚ» және рибонуклеин «РНҚ».

ДНҚ-ның құрылымы, саны және қасиеттері.

ДНҚ-ң құрылымын зерттеген көптеген тәжірибелердің нәтижесінде, 40–жылдардың аяғында төмендегідей мәліметтер белгілі болды:

1.ДНҚ 4 нуклейдтен (аденин, гуанин, цитозин, тимин) тұрады. Олардың алдынғы екеуі екі, ал қалғандары бір сақинадан құралған. Әр нуклеотид бесбұрышты қантпен коваленттік байланыс арқылы қосылған фосфат тобымен азоттық негізден тұрады.

2.нуклеотидтер бір-бірімен қант және фосфор тобымен ковалентті байланыс арқылы қосылған. Осы фосфор тобымен қанттың қалдығына тұратын ұзын шиыршықты молекуланы қант-фосфорлы тұлғасы дейді.

3.Э.Чаргафф анықтаған ДНҚ-ның барлық молекуласындағы адениннің (А) саны тиминмен (Т) бірдей, ал гуаниндікі (Г) цитозинмен (Ц) тең; оны қысқаша былай белгілейді А=Т, Г=Ц

Аденин мен тимин екі сутектің байланыспен, ал гуанин мен цитозин үш сутектік байланыс арқылы қосылыс түзеді

4.ДНҚ-ның молекуласы шиыршық (оралма) болып оралған. Оның негіздері шиыршыққа тік бұрышпен орналасады. Оны ең алғаш Р.Франклин түсірген рентгенограммадан көруге болады. Рентгеннограмманың көмегімен қант-фосфорлы тұлғаның шиыршықтың сыртқы жағында, ал негізі іште екенін және шиыршықтың бір орамында он нуклеотид болатыны  анықталды.

Р.Франклин ашқан деректердің ДНҚ-ның ќұрамын анықтауда маңызы зор болды, бірақ екі сұрақ жауапсыз қалды: ДНҚ-ның молекуласы қанша жіпшеден тұрады және олар қалай байланысқан. Бұл сұрақтың жауабына негіз болған 1953 ж Ж.Уотсон мен Ф.Крик ұсынған ДНҚ-ның  құрылымы еді. Олар ұсынған құрылымды ДНҚ молекуласы 2 жіпшеден немесе тізбектен тұрады. Бұл жердегі жіпшелердің орнында осы тізбектердің қант-фосфатты тұлғасы тұрады да ал баспалдақтың рөлін  негіздер атқарады. әрбір баспалдақ 2 негізден тұрса олардың екі, ал екіншісі бір сақинадан тұрады.

Енді ДНҚ-ның қосарлы сақинасының қалай түзелетіндігін қарастырайық. Мұнда бір тізбектің азотты негіздері екінші тізбектің азотты негіздерімен сутектік байланыс арқылы өзара жақын орналасқан.

Сутектік байланыстың түзулуінің өзі азотты негіздердің өте жақын түйісунің нәтижесі деп түсінген дұрыс.

Түйісетін нуклеотидтер белгілі бір заңдылықта бағынады атап айтқанда бір тізбекте А орналасса, екінші тізбекте оның қарсысында Т орналасады, яғни А-ге Т комплементті, ал Г-ге Ц комплементті болып орналасады. Нуклеотидтердің осылай комлементке сай орналасуының нәтижесінде, біріншіден, қосарлы сақинаның бүкіл ұзына бойындағы тізбектердің ара қашықтығы бірдей болады, екіншіден, қарама-қарсы орналасқан негіздердің арасы сутектік байланыстар арқылы қосылады. Мәселен, Г мен Ц 3 сутектік байланыс, ал А мен Т арасындағы 2 сутектік байланыс түзіледі. Неғұрлым сутектік байланыс көп болса, ДНҚ жіпшелері дерт болады және оның молекуласы түрақты болып, қозғалғыштығы сақталатындығы дәлелденді.

Қорыта келе, Ж.Уотсон мен Ф.Крик ашқан ДНҚ молекуласы құрылымының дұрыстығы экперимент жүзінде толық дәлелденіп молекулалық биология мен генетиканың дамуына зор ықпалын тигізді.

1-Сурет. ДНҚ компоненттерінің құрылымдық формуласы. А. Нуклеотид. Аденин, гуанин, цитозин или тимин негізі болып табылады.Түрлі-түсті штрих сызығы қант қалдығы (дезоксирибоза): санмен углеродты атомдары белгіленген.Б. негіздері.Түрлі-түсті штрих сызығы азот атомы

 

ДНҚ-ның екі еселенуі

Жасуша бөлінер алдында ДНҚ екі еселенеді, яғни жаңа жасушадағы генетикалық ақпарат «ескімен» бірдей болады. Қос тізбектегі негіздер бірдей болғандықтан, кез-келген жұп өзінің қарсы жағының қалыптасуына ақпарат береді. Мысалы, бір тізбек А – Т – А – Т – Ц – А болса, оның қарсысында Т – А – Т – Ц – Г – Т. Олар нуклеотидтердің комплементтік негізіне сәйкес келеді. ДНҚ-ның екі еселенуінің жолын 1953 ж М.Н.Мейсельсон мен Ф.Сталь дәлелдеді. Алғашқыда олар 3 түрлі болжам ұсынды:

1.Сақтала екі еселену. Жаңа тізбекте молекула пайда болу үшін алдыңғы ДНҚ-ның қос оралымының қалпы (матрица) негіз болады. Жаңа жасушаның біреуі бұрынғы ДНҚ-ның молекуласын алса, ал екіншісі жаңадан синтезделген молекуласын алады.

2.Жартылай сақтала екі еселену. Азотты негіздер арасындағы әлсіз сутектік байланыстары үзілген соң негіздер ыдырап, ДНҚ молекуласының қос тізбегі ашылған сырма сияқты екі жаққа кетеді. Бүлінген әрбір тізбек болашақта пайда болатын тізбекте қалып қызметін атқарады. «Жаңа» және «ескі» тізбектер сутектік байланыстар арқылы қосылады. Яғни жаңа жасушада «жаңа» және «ескі» тізбектерден тұратын ДНҚ молекулалары түзіледі

3.Бытыраңқы екі еселену. ДНҚ қысқа бөлшектерге ыдырап, жаңадан пайда болатын қос тізбектің негізін қалайды. Одан кейін ДНҚ белгісіз жолмен екі еселенеді.

2-Сурет.ДНҚ молекуласы тізбектерінің бірі

3-Сурет.ДНҚ екі қабатты спиралінің моделі

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.1.2 ДНҚ бөліп алу

ДНҚ бөліп алуға арналған реагенттер:

ACD ерітіндісі (+40С температурада сақтау қажет). Көлемі 100 мл-лік ыдыста 0,48 г лимон қышқылы, 1,42 г натрий цитраты және 1,47г глюкозаны дистилденген суда ерітеді.

А реагенті (+40С температурада сақтау қажет). 10 мМ Трис-НСL, рН=8,0; 320мМ сахароза; 5мМ MgCL2; 1% Тритон Х-100.

В реагенті (бөлме температурасында сақтайды). 400мМ Трис-HCL, рН=8,0; 60мМ ЭТДА, рН=8,0; 150мМ NaCL; 1% SDS.

Перхлоратты натрий ерітіндісі (бөлме температурасында сақтайды). 5М Na-перхлораты.

К протеиназа ерітіндісі (+40С температурада сақтайды). 20мг/мл дистилденген суда дайындайды.

CLA (+40С температурада сақтайды). 24 айн. хлороформды 1 айн. изоамил спиртпен араластырады.

TE буфері (бөлме температурасында сақтайды). 10мМ Трис-HCL, рН=7,5; 1 мМ ЭТДА, рН=8,0.

ДНҚ бөліп алу технологиясы. Құлақ үлпасынан ядролық ДНҚ бөліп алу технологиясы жетілдірілген перхлораттық әдістемесі арқылы жүргізілді [Гладырь Е.А. жєне т.б., 2001].

Алынған ұлпа үлгісінің түтікшеге 2-3 мм2  салып, оған  150 мкл  В реагентін және 5 мкл  К протеиназаны  (20 мг/мл) қосып, 8-20 сағат  бойы  600С температурада инкубациялайды. Жасушалық  лизатқа 0,33 айн. (50 мкл) 5М Na-перхлоратының ерітіндісін  қосып араластырады. Одан  кейін 1,5 айн. (300 мкл) CLA қосып, 3-5 минут араластырып, 15000 айн/мин центрифугада 5 минут ұстайды. Үстіңгі қабатта түзілген ДНҚ-н ұқыптылықпен аралық қабатпен араластырып алмай таза түтікшеге құйып алады. Алынған ДНҚ-ы  бар фазаға 2 айн. (600 мкл) 100%-тік этил спиртін ДНҚ-н тұндыру үшін қосады, оны араластырғаннан кейін ДНҚ көпіршіктері түзіледі. Егер ДНҚ көпіршіктері түзілмесе 15000 айн/мин центрифугада 2-3 минут түтікшені қайтадан ұстайды.

Көпіршіктер түзілгеннен кейін сұйықтықтан бөліп алып, оған 0,5-10 мл  70% этанол  (-200С температураға дейін салқындатылқан) қосып және 5-10 минут бөлме температурасында инкубациялайды. Спиртті бөліп алғаннан кейін көпіршіктерді аударып 20-30 минут бойы бөлме температурасында кептіреді.

Түтікшеде түзілген заттары 50-100 мкл  дистильденген  сумен  немесе  ТЕ  буферлі ертіндісімен өңделді.

 

 

 

 

 

 

 

ДНҚ Вакциналарды алу

ДНҚ-вакциналарды алу технологиясы микроорганизмдердің протективті антигендер синтезін кодтайтынДНҚ фрагменттердің өндірісі, көп мөлшерде амплификациялануына негізделген. Әрі қарай осы ДНҚ плазмидалар немесе вирустар негізіндегі векторларға ендіреді де егілетін адамның клетка және тіндеріне трансфекциялайды, ДНҚ-вакцина алу үшін жиі микроорганизмнің протективті антигенін кодтайтын гендерін клетка цитоплазмасында автономды репликацияға қабілетті бактеиялық плазмидаларға ендіреді. Иммуногенді микробты протеин синтезін кодтайтын геннен басқа плазмидағаадам организм клеткаларында трансфекцияланған ДНҚ жоғары экспрессиясы үшін гендік конструкцияны (иниицирленген және терминацияланған кодондар, промотор) қондырады.Нәтижесінде нақты қоздырғыштарға қарсы иммунды жауаптарын қалыптастыруын тудыратын протективті микробты антиген өндіріледі. Плазмида құрамындағы ДНҚ-вакцина цитоплазмада орналасады және адам хромосомасының ДНҚ интеграцияға түспейді, яғни организмде гендік қайтара өзгеруін тудырмайды. Осыған ұқсас ДНҚ-вакциналарды тұзды ерітіндіде парентеральді (бұлшықетке, қантамыр ішіне)енгізеді. Инъецирленген ДНҚ-вакцинаның бір бөлігі плазмида құрамымен клетка аралық кеңістіктен клетка ішіне енеді.