Мелекулярно-генетические методы исследования в биологии и медецине

Реферат на тему:

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ

Введение

Практическое применение методов  молекулярно-генетической диагностики  в медицине, животноводстве и растениеводстве в последние десятилетия неуклонно растет. К настоящему времени в генетике сложились две стратегии генетического анализа: «классическая» - исследование генетической обусловленности признака (путь от признака к гену) и «обратная» - исследование фенотипических эффектов отдельных генов (путь от гена к признаку). Как классическая, так и обратная генетика располагают широким арсеналом методов. Гипотезы о схеме наследования признака (признаков) строят на основе статистического и вероятностного анализа данных, полученных в расщеплениях.

Широкие перспективы для решения  как фундаментальных, так и прикладных биологических задач открывает применение молекулярных методов анализа, которые позволяют манипулировать с наследственным материалом на уровне молекул ДНК. Бурное развитие молекулярная генетика претерпела во второй половине двадцатого века после открытия структуры ДНК, расшифровки генетического кода, открытия механизмов транскрипции и трансляции генов. У прокариотических организмов обнаружили явление горизонтального переноса генетической информации с помощью транспозонов, плазмид и фагов, что позволило применять их в качестве векторов, доставляющих гены в реципиентные клетки. Разработана технология получения рекомбинантных молекул ДНК, которые образуются в результате объединения нескольких фрагментов ДНК, выделенных из различных источников. Появились методы молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

1 Гибридизации с мечеными ДНК-зондами. блот-гибридизация по Саузерну, гибридизация in situ.

Одним из эффективных методов  идентификации определенных молекул  ДНК среди электрофоретически разделенных  фрагментов является ставший уже  классическим метод блот-гибридизации по Саузерну, названного по фамилии  автора (Edward Southern), предложившего данный метод в 1975г. Последовательные этапы данного метода представлены на рисунке 2. Суть метода – рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами, после чего образующиеся фрагменты разделяются по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (обычно нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану).

Рисунок 1. Саузерн-блоттинг

Сам перенос (блоттинг) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума. Фиксированную  на фильтре ДНК гибридизуют с  радиоактивно меченым ДНК- или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме. Блот-гибридизация – высоко чувствительный метод идентификации  специфических последовательностей  ДНК. При длительной экспозиции (в  течение нескольких дней) и при  высокой удельной радиоактивности  ДНК-зонда (более 10⁹ расп./(мин × мкг)) этот метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДНК. Так при использовании зонда размерами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 1000 п.о. может быть выявлена в 10 мкг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на радиоавтографе после экспозиции в течение 12 часов. Метод позволяет работать и с очень короткими олигонуклеотидными зондами (20 п.о.), однако требует особенно хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра. Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры делают ее весьма дорогостоящей. Тем не менее, в ряде случаев и сегодня метод не потерял своего значения, в том числе и для диагностики генных болезней. В последнее время для этих целей нередко используют различные варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра.

Гибридизация с меченым  ДНК-зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс  без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот-гибридизации в зависимости  от конфигурации пятна ДНК на фильтре  – округлой или продолговатой, соответственно. Попутно отметим, что метод гибридизации ДНК-зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название Нозерн-блот, тогда как Вестерн-блот, или иммуноблот, - это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных  на фильтрах, с мечеными антителами. Название этих методов – дань уважения молекулярных генетиков проф. Э. Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку экспериментальных подходов, используемых для анализа ДНК. В ряде случаев  для проведения гибридизации с ДНК-зондами  не требуется предварительного выделения  и очистки ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле, на фильтрах или в растворе, но и  на гистологических или хромосомных  препаратах. Этот метод носит название гибридизации in situ. Вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДНК или РНК, меченые флюорохромами, называется FISH (fluoresce in situ hybridization). Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК. Важное значение имеет также подбор условий, максимально способствующих процедуре гибридизации. После отмывки несвязавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (при использовании радиоактивной метки), либо проведения соответствующей обработки (при использовании биотин- или флюоресцеин-меченых ДНК-зондов) места локализации последовательностей ДНК, комплементарных использованному ДНК-зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных точек над соответствующими участками определенных хромосом .

Гибридизация in situ является одним из наиболее эффективных методов картирования комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения, при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутрихромосомной локализации уникальных генов в тех случаях, когда имеются соответствующие ДНК-зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов. Согласно последним данным, в экспериментах на специально приготовленных и растянутых интерфазных хромосомах человека разрешающая способность метода FISH может достигать 50 тыс. п.о.

Проблемы взаиморасположения клонированных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса также с успехом решаются методом  FISH.

Гибридизация in situ между молекулами РНК и кДНК-зондами проводится на гистологических препаратах и является одним из наиболее эффективных методов анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК.

2 Секвенирование последовательностей ДНК. метод Сэнджера (Сенгера).

Следующими этапами анализа  отобранного и клонированного ДНК-фрагмента  являются его физическое картирование и определение нуклеотидной последовательности, т.е. секвенирование. Методология секвенирования достаточно проста и заключается  в том, чтобы получить серию комплементарных  молекул ДНК, различающихся по длине  на одно основание. На практике, однако, определение нуклеотидной последовательности протяженных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую задачу. Существует три основных метода секвенирования: химическое – метод Максама-Гильберта, дезоксисиквенирование – метод  Сэнджера (Сенгера), метод Тодда –  последовательное расщепление фосфодиэфирной связи с последующим анализом экстрагированных гетероциклических  оснований. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором – синтезируют  нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез на заданном основании.

Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, т.к. он более  надежен и прост в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий  праймер – искусственно синтезированную  олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному  участку исходной молекулы ДНК. Создают  условия для гибридизации праймера, т.е. для образования двухцепочечного  участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты –  dATP, dCTP, dGTP и dTTP, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четырех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют один из специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминаторов – ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP (ddNTP). При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Т.о., в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченых фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы.

После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех  соседних дорожках и радиоавтографии  размер синтезированных фрагментов может быть определен, а значит, определена и локализация дидезоксинуклеотидов, и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДНК. На каждом секвенирующем геле может  быть определена первичная последовательность всего около 500 п.о. В своем первоначальном варианте этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК в Международной  программе «Геном человека» еще  несколько лет назад оценивалась  в 1 $. В качестве модификаций метода Сэнджера используют предварительное  клонирование ДНК в векторах, сконструированных  на основе фага М13 для получения  протяженных однонитевых участков ДНК, которые могут быть непосредственно  секвенированы без денатурации  и праймирования. Очень эффективной  оказалась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс одновременно в обоих направлениях и прочитывать участки большей протяженности.

Особенно перспективным  для массового секвенирования в  автоматическом режиме оказалось применение меченых флюорохромами дидезоксинуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов  соответствует свой цвет полосы в  геле, что хорошо различается в  автоматическом режиме. Этот метод  нашел особенно широкое применение в реализации программы «Геном человека». Разработка автоматических секвенаторов позволила снизить стоимость  одного звена и резко повысить эффективность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах фирмы  Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994 г. можно было просеквенировать до 1 млн п.о.

Рисунок 2.  Пример хроматограммы, на современном секвенторе, использующий метод обрывания цепи Сангера и светящуюся метку

Разрабатывались принципиально  новые, более эффективные и экономичные  методы секвенирования. Особенно перспективным  в1997 г. представлялся метод секвенирования путем гибридизации исследуемой  последовательности ДНК с набором  олигонуклеотидов, так называемой олигонуклеотидной  матрицей. Наиболее удобными для этой цели являются наборы матриц – чипы, в ячейках которых прошиты (иммобилизированы) октануклеотиды. Суть данного подхода  в том, что прошивается набор  всех возможных вариантов перестановок из четырех стандартных нуклеотидов (A,G,C,T) определенной длины, при этом в случае октануклеотидов количество возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется только с теми октануклеотидами, последовательности которых комплементарны его участкам. Т.о., определяется набор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в исследуемом фрагменте ДНК. После этого при помощи специальной компьютерной обработки упорядочивается расположение этих октамеров в изучаемом фрагменте ДНК.

3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) предложен в середине 1980-х гг. Маллисом, который с соавторами описал амплификацию однокопийных генов млекопитающих in vitro с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Широкое распространение этот метод получил с началом применения в реакции термостабильной полимеразы бактерии Thermus aquaticus (Taq), использование которой позволило автоматизировать процесс. Сейчас ПЦР проводят в специальном приборе - амплификаторе, обеспечивающем с высокой точностью периодическое охлаждение и нагревание реакционных смесей. Метод ПЦР оказался настолько простым и удобным, что без него в настоящее время не обходится практически ни одно молекулярно-генетическое исследование.

В реакционную смесь для ПЦР помимо Гад-полимеразы входят ДНК-матрица, праймеры, дНТФ и ионы магния. Реакция проходит в три этапа.

На первом этапе проводят тепловую денатурацию (при 94-95°С) матричной ДНК, с которой будет производиться копирование. При этом происходит разрушение водородных связей и разделение двух комплементарных цепей ДНК. Время денатурации зависит от комплексности и нуклеотидного состава матрицы: чем длиннее матричная ДНК и чем выше в ней содержание тугоплавких пар нуклеотидов G-С, тем больше требуется времени для ее денатурации.

На втором этапе проводят отжиг (гибридизацию) праймеров на денатурированных цепях Д НК. Праймеры - затравки длиной 20-30 н. - служат для инициации полимеразной реакции. В стандартном случае подбирают пару праймеров (прямой и обратный) к разным цепям амплифицируемой молекулы ДНК так, чтобы синтезируемые цепи были комплементарны друг другу и образовывали двухцепочечную структуру. Температура, при которой проводится второй этап, варьирует и зависит, главным образом, от нуклеотидного состава праймеров. Как правило, температура отжига Т_а на 3-5°С ниже температуры плавления Т_а комплекса праймер-матрица. Т_м можно определить как температуру, при которой праймер присоединяется к половине возможных сайтов связывания. Для праймеров длиной 20-30 н. Т_т можно приблизительно определить по формуле Т_m = 2 (n_А + n_Т) + 4 (n_G + n_c), где n_х -количество нуклеотидов X (А, Т, G или С) в праймере. При подборе праймеров обязательно обращают внимание на распределение нуклеотидов по длине (оно должно быть равномерным) и GC-состав (40-60%). Праймеры, используемые в одной реакции, должны иметь близкую температуру плавления и не содержать комплементарных участков. Стандартная реакция ПЦР включает 6 х 10¹² - 6 х 10¹³ молекул каждого праймера. Этого количества вполне достаточно для проведения 30 циклов амплификации фрагмента ДНК размером 1 т.п.н. Более высокие концентрации праймеров могут приводить к неспецифичному отжигу праймеров и, как следствие, к неспецифической амплификации.

Рисунок 3. Подбор праймеров

На третьем этапе, называемым элонгацией, ДНК-полимераза синтезирует  с праймеров вторые цепи ДНК. Существует несколько термостабильных полимераз, которые варьируют по точности, эффективности и способности синтезировать длинные молекулы ДНК. Наиболее распространенной является Год-полимераза. Как упоминалось ранее, Год-полимераза имеет 5'-3’-полимеразную активность и 5’-3 ’-экзону клеазную активность, но не имеет корректирующей 3’-5 '-экзонуклеазной активности (в отличие от ДНК-полимеразы Е. coli). Это означает, что при ошибочном включении неспаренного нуклеотида во время синтеза Год-полимераза не может исправить свою ошибку, что ведет либо к обрыву синтеза в точке ошибки, либо к появлению продуктов с ошибками, если обрыва в точке ошибки по каким-то причинам не произойдет. Размер фрагмента, синтезируемого Год-полимеразой, обычно не превышает 5 т.п.н.