Мелекулярно-генетические методы исследования в биологии и медецине

Для высокоточной амплификации ДНК применяют полимеразу Pfiiy  выделяемую из археи  Pyrococcus furiosus; эта полимераза имеет 3’-5’-экзонуклеазную активность. Однако P/w-полимераза довольно требовательна к условиям реакции, ее процессивность невысока, и размер продукта, синтезируемого даже в самых благоприятных для ее работы условиях, не превышает 3 т.п.н.

Температура элонгации зависит  от оптимума работы полимеразы, Для  термостабильных полимераз - это 75-80°С. Однако температуру синтеза в ПЦР задают несколько ниже - 72°С. Время этапа элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Год-полимеразе для элонгации 1 т.п.н. обычно достаточно одной минуты, P/w-полимеразе на это требуется две минуты.

Три этапа составляют цикл, и продукт реакции одного цикла  является матрицей для синтеза в  следующем цикле ПЦР. После первого  цикла ПЦР на матрице синтезируются  цепи ДНК, ограниченные последовательностями праймеров только с 5’-концов, после второго цикла ПЦР образуются продукты со свободными 3'-концами. В третьем цикле появляются первые молекулы, с двух сторон фланкированные последовательностями праймеров.

Теоретически, ДНК должна амплифицироваться в возрастающей геометрической прогрессии со знаменателем 2:    в каждом последующем цикле количество продукта увеличивается в 2 раза, таким образом, в последнем цикле из одной двухцепочечной молекулы ДНК образуется 2ⁿ молекул ДНК, где п — число циклов реакции. Из N₀ молекул ДНК через п циклов образуется N_n=N₀2ⁿ молекул ДНК. На самом деле эффективность каждого цикла меньше 100 %, поэтому в действительности количество продукта пропорционально (1+Е)^п, где Е - средняя эффективность цикла (0 < Е < 1): N_n = No(l + Е)ⁿ. На эффективность ПЦР влияет количество реагентов, присутствие ингибиторов в смеси, образование побочных продуктов. В связи с этим, на последних циклах реакции рост количества продукта замедляется, и это называют «эффектом плато». Оптимальным количеством циклов для ПЦР обычно считают 25-30.

Метод ПЦР открывает широкие  перспективы для генетических исследований. С его помощью можно клонировать  гены (фрагменты генов), устанавливать  их структурную организацию, проводить поиск мутаций в генах, направленно вводить в них мутации, исследовать экспрессии генов, строить их молекулярные карты, секвенировать.

Рисунок 4. Принцип полимеразной цепной реакции

В ряде случаев метод ПЦР  незаменим, поскольку обладает высокой  чувствительностью; это относится, прежде всего, к исследованиям (например, палеонтологическим или криминалистическим), имеющим дело с микроколичествами ДНК, с которыми невозможно проводить гибридизацию. ПЦР позволяет обнаружить в образце одну единственную молекулу ДНК. С его помощью можно также анализировать следовые количества РНК, предварительно транскрибировав их в ДНК при помощи обратной транскриптазы. Совокупность методов обратной транскрипции и ПЦР образуют новый метод, применяемый для анализа транскрипции генов, - ОТ-ПЦР.

ПЦР в реальном времени

Для количественной оценки амплификации ДНК используют ПЦР  в реальном времени (или количественную ПЦР - quantitative PCR -qPCR), которая дает информацию о кинетике реакции. Принципиальной особенностью реакции является мониторинг и количественный анализ накопления продуктов с применением флуоресцентных методов, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Реакцию проводят в особом приборе, представляющем собой амплификатор, совмещенный с флуориметром. На сегодняшний день единственным препятствием широкого использования ПЦР в реальном времени является довольно высокая стоимость прибора.

Для количественной оценки ПЦР применяют либо флуоресцентные красители, интеркалирующие в двухцепочечные молекулы ДНК, либо модифицированные праймеры, которые флуоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

В качестве интеркалирующего красителя используют флуоресцентный цианиновый краситель SYBR Green I. Его добавляют  в реакционную смесь, которая, в  остальном, не будет принципиально отличаться от смеси стандартной ПЦР. Возрастание количества двухцепочечных продуктов ПЦР будет приводить к увеличению флуоресценции .

Рисунок 6. ПЦР (qPCR) - метод с использованием интеркалирующего красителя

Недостаток метода состоит  в том, что краситель будет  одинаково эффективно связываться как со специфичным ПЦР-продуктом, так и с неспецифичным. Кроме того, SYBR Green I с низкой эффективностью способен связываться с одноцепочечными нуклеиновыми кислотами. Все это может приводить к снижению точности количественной оценки ПЦР.

В методе с использованием репортерного праймера используют олигонуклеотид, который способен отжигаться внутри амплифицируемой последовательности ДНК. Его длина составляет 20-24 н., на 5-конце он несет флуоресцентную группу, на З'-конце -«гасящую» флуоресценцию группу. Меченый олигонуклеотид добавляют в ПЦР-смесь вместе со специфичными прямым и обратным праймерами. Он отжигается на одной из цепей ДНК параллельно с одним из специфичных праймеров.

Рисунок 7 ПЦР в реальном времени – метод с использованием  репортерного праймера

Когда флуоресцентная и гасящая группы находятся в составе праймера, любая эмиссия репортерной группы поглощается гасителем, и флуоресценция близка к нулю. На стадии синтеза Taq-полимераза, обладающая 5’-3’-экзонуклеазной активностью, отщепляет флуорофор. Будучи больше не связанным физически с гасителем, он начинает флуоресцировать.

Для повышения специфичности детекции вместо одного меченого праймера можно использовать сразу два. Праймеры подбирают таким образом, чтобы они отжигались на одной из цепей последовательно на расстоянии 1-3 нуклеотида друг от друга, и метят флуорофорами: первый - на 3’-конце, второй - на 5’-конце. Принцип метода – перенос энергии от одного флуорофора, находящегося на З'-конце первого праймера, ко второму флуорофору, находящемуся на 5’-конце второго праймера. При одновременном связывании обоих праймеров с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа. Основным недостатком методов с использованием репортерных праймеров, по сравнению с методами, использующими интеркалирующие красители, является их высокая стоимость.

Самое трудное в методе ПЦР в реальном времени - это интерпретация результатов. Высокая чувствительность метода даже к малейшим изменениям условий реакции приводит к искажениям результатов. Поэтому необходимо очень внимательно относится к подбору условий и ставить эксперимент в нескольких повторах с хорошими контролями.

При оценке результатов ПЦР исходят из того, что через п циклов сигнал флуоресценции (F_n) в пробе должен быть с некоторым коэффициентом (к) пропорционален числу молекул ДНК (Nⁿ): F_n = kNⁿ, или, учитывая эффективность (Е): F_n = kN₀(l+E)ⁿ, где N₀ -исходное количество молекул ДНК. Коэффициент к может отличаться в разных экспериментах и пробах. На коэффициент также влияют настройки приборов, параметры пробирок, точность разнесения реактивов по пробиркам и т.п.

Для сравнения графиков ПЦР часто используют пороговый метод - определение порогового цикла реакции C_t (threshold cycle), который задаёт точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии. Величина C_t выражается в циклах ПЦР, когда количество ДНК в пробирке (и флуоресцентный сигнал) достигает одинаковой, обычно заданной пользователем, пороговой величины Nt. Сравнивая значения C_t можно судить о начальных концентрациях ДНК в исследуемых образцах. Чем меньше значение С_ь тем больше было ДНК в образце в начальный момент времени. Сравнительный анализ значений C_t проводят во время экспоненциальной фазы ПЦР. Очевидно, что на значения C_t большое влияние будет оказывать эффективность реакции. Эффективность реакции можно определить путем проведения ПЦР с последовательными десятикратными разведениями исследуемого образца. После реакции для каждого разведения определяют значение C_t. Затем строят калибровочную кривую.

Часто ПЦР в реальном времени используют для количественной оценки транскрипции генов в комбинации с методом обратной транскрипции. Считается, что при правильной постановке эксперимента метод ПЦР в реальном времени в несколько раз эффективнее Нозерн-блоттинга. При оценке экспрессии генов на уровне транскрипции используют внешние контроли – стабильно экспрессирующиеся в тестируемых условиях гены, например, гены рРНК или гены домашнего хозяйства (глицеральдегидцегидрогеназы, b-актина, гистона 3 и др.). В опыте анализируют относительную экспрессию исследуемых генов, нормированную на экспрессию референсных генов. Однако к выбору референсного гена, от которого зависит трактовка результатов, необходимо относиться аккуратно и учитывать стабильность его транскрипции в тестируемых условиях.

4 Гибридизационный  анализ днк с использованием  биологических микрочипов

Микрочип представляет собой  твердый носитель (стекло, пластик, или силикон) размером чуть более 1,5 см² с прикрепленной на нем коллекцией зондов (до нескольких сотен тысяч) к большому количеству генов генома. Микрочип используют для гибридизации с геномной ДНК или РНК, переведенной в кДНК (или комплементарную мРНК), которую предварительно флуоресцентно метят. Первый микрочип был сделан для генома дрожжей Saccharomycescerevisiae,и результаты анализа экспрессии опубликованы в 1997 г. В настоящее время общедоступны микрочипы с геномами Е. coli,нематоды Caenorhabditiselegans, дрозофилы, арабидопсиса, мыши, крысы и человека. ДНК- микрочипы применимы для анализа изменения экспрессии генов на уровне транскрипции, выявления однонуклеотидных полиморфизмов, генотипирования и секвенирования геномов.

В качестве зондов используют олигонуклеотиды, кДНК или небольшие  фрагменты генов, соответствующие  их кодирующим участкам и полученные в ПЦР. ЗонДы либо непосредственно  синтезируются на поверхности носителя, либо наносятся на микрочип с помощью  микроробота.

На рис. 7 представлена схема  фотолитографического химического  синтеза олигонуклеотидных зондов на поверхности микрочипа. Поверхность  микрочипа покрывается линкером (полилизином), защищенным протекторными  группами, препятствующими присоединению  нуклеотидов. Каждый добавляемый дНТФ также несет протекторную группу, это препятствует присоединению  более одного дНТФ. Эта группа фотолабильна - чувствительна к ультрафиолету. Для синтеза зондов на микрочип последовательно  накладывают комплект фильтр-масок. Фильтр-маска позволяет избирательно снимать протекторные группы ультрафиолетом и присоединять к «открытым» гидроксильным  группам определенный дНТФ.

Размер синтезируемых  таким образом олигонуклеотидных  зондов составляет 25-60 н.

Рисунок 7. Синтез олигонуклеотидных зондов

 

Существуют различные  варианты гибридизации на микрочипах. Один из вариантов - сравнительная геномная гибридизация на микрочипах. Этот метод  позволяет одновременно проводить генетический анализ на уровне транскрипции целого генома. Например, с его помощью можно проводить сравнительный анализ экспрессии на уровне транскрипции генов в нормальных и мутантных клетках или анализ ответной реакции генома на уровне транскрипции при воздействии различных стрессовых факторов среды.

Часто для гибридизации используют не меченую кДНК, а меченую комплементарную мРНК (кРНК), полученную из кДНК. Для этого с тотальной мРНК считывают кДНК с использованием праймера олиго (дТ), фланкированного на 5-конце последовательностью промотора фага Т7. Затем осуществляют прямую транскрипцию с промотора фага Т7 с помощью Т7-РНК- полимеразы. При этом синтезируется кРНК, которая, по сути, является антисмысловой к мРНК. В реакцию добавляют аминоаллил- дУТФ, модифицированный СуЗ или Су5 (рис. 8). Таким образом амплифицируют мРНК и повышают чувствительность метода гибридизации.

Рисунок 8. Синтез кРНК для гибридизации на микрочипе

 

После гибридизации оценивают  ее результаты - сканируют флуоресценцию. Микрочип обычно содержит контрольные  зонды, которые гибридизуются с  контрольной (spike-ins) РНК, добавленной в строго определенном количестве. Степень гибридизации между контрольной РНК и контрольным зондом используют для нормализации измерений гибридизации других зондов. Для качественной и количественной оценки транскрипции генов оценивают относительную интенсивность флуоресценции. Если транскрипция какого-либо гена в образцах А и В одинаковая, то зеленая флуоресценция будет смешиваться с красной, в результате чего область гибридизации будет детектироваться как желтое пятно. Если транскрипция гена выше в образце А, то флуоресценция будет наблюдаться от желтой до зеленой области спектра, если транскрипция гена в образце А ниже, то флуоресценция будет наблюдаться от желтой до красной области спектра (рис. 9).

Рисунок 9. Принцип гибридизации на микрочипе

Иногда измеряют абсолютный уровень транскрипции генов. В этом случае кДНК или кРНК каждого образца  независимо гибридизуют с чипом. При этом используют только одну флуоресцентную метку. Преимущество такого подхода  состоит в том, что он позволяет  оценивать экспрессию генов в  абсолютных величинах.

 

Заключение